轻简化液质联用法检测玉米中的伏马毒素B1、B2和B3

郑 嘉，王红旗，刘继红，王俊艳，曹 成，尹海燕

（1. 河南省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，河南 郑州 450002；2. 河南省粮食质量安全与检测重点实验室，河南 郑州 450002；3. 农业部农产品质量安全风险评估实验室，河南 郑州 450002）

伏马毒素于1988 年被首次发现[1⁃2]，LAURENT等[3]从伏马菌素中分离出伏马毒素B1（FB1）和伏马毒素B2（FB2）。伏马毒素是由一类串珠镰刀菌、多育镰刀菌、轮状镰刀菌和尖孢镰刀菌等在一定温度和湿度条件下产生的水溶性次级代谢产物，主要污染玉米及其制品[4⁃6]。伏马毒素类似物有28种，分为A、B、C、P 等4 组，以B 组的FB1、FB2和伏马毒素B3（FB3）为主要存在形式，这3 种毒素的结构非常相似[7]。其中，FB1毒性最强，广泛存在于玉米及其制品中，约占伏马毒素总量的70%[8]。在我国西南山地玉米种植区，如四川、云南、贵州等地，全年降雨较多，玉米饲料原料中伏马毒素检出率高，污染严重[9⁃10]。前人研究表明，伏马毒素毒性具有种属、性别的特异性，不同种属动物对伏马毒素的敏感性不同，同一种动物不同性别对伏马毒素的敏感性也不同[7]。FB1可引起马脑白质软化症（ELEM）[11]、猪肺水肿综合征（PPE）[12]以及小鼠、羔羊、小牛不同程度肝细胞凋亡和肾毒性，诱发灵长类动物动脉粥样硬化[13]和食道癌[14]，对动物养殖业及人类健康有较大影响。

由于FB1和FB2在天然食品中含量高于FB3，且FB1和FB2的毒性比FB3强，目前的检测方法和限量标准主要针对FB1和FB2。欧盟对玉米中伏马毒素（FB1+FB2）进行限量：玉米为4 mg/kg，婴幼儿玉米制品为0.2 mg/kg，玉米基质早餐及点心为0.8 mg/kg，其他用于人类直接消费的玉米及玉米食品为1 mg/kg。瑞士规定食物中伏马毒素限量为1 mg/kg[15]；美国FDA 规定直接食用玉米和玉米产品中伏马毒素（FB1+FB2+FB3）限量为2 mg/kg。我国虽然制定了食品、粮食及饲料中伏马毒素的检验方法，但并无明确的限量规定[16]。

随着人们对食品安全越来越关注，农产品及食品中伏马毒素的检测逐渐引起了人们的重视。因伏马毒素化学结构简单，无紫外吸收基团，无荧光特性基团,现有的伏马毒素色谱检测方法大多需要使用合适的衍生剂，增加了检测过程的烦琐性。另外，关于伏马毒素的提取与净化，现有的伏马毒素检测方法如液相色谱法、气相色谱法、气-质联用法、液-质联用法[17⁃21]等，大多数需要使用免疫亲和柱或者阴离子固相萃取柱，检测成本高且只能检测1 种或2 种伏马毒素。魏云计等[20]报道的方法能够同时检测3 种伏马毒素，但是需要用PRIME HLB 固相萃取柱对样品进行净化前处理，检测成本高，操作相对烦琐。

2012 年，我国农业农村部依法建立国家农产品质量安全风险评估制度，并按年组织实施农产品质量安全风险评估工作，产品涵盖小麦、玉米、花生、茶叶、稻米等，需要评估的真菌毒素项目有20多种。每年需要评估的玉米样品超过1 000 份，需要评估的真菌毒素种类有十几种，其中包括FB1、FB2、FB3。根据索莱宝生物科技有限公司、北京博尔西科技有限公司、武汉华美生物工程有限公司3 家公司的报价，伏马毒素免疫亲和柱均价约为160 元/支。按照每份玉米样品做3 个平行进行检测成本核算，不包括过柱子消耗的人力成本和时间成本，每年仅完成国家玉米风险评估项目需要支付的伏马毒素免疫亲和柱试验耗材费用就高达48万元。

真菌毒素种类繁多且存在毒性协同叠加效应。为准确、全面、快速掌握粮油产品及其制品中真菌毒素的污染情况，急需建立一种非免疫亲和柱依赖型简单、快速、灵敏、准确的粮油产品多种真菌毒素筛查方法。为此，采用轻简化液质联用法，在不使用免疫亲和柱和阴离子固相萃取柱的前提下，通过优化提取液组分、色谱分离条件和高分辨质谱检测条件，同时测定玉米中3 种伏马毒素（FB1、FB2、FB3）的含量，为建立满足大批量样品中伏马毒素筛查分析与风险评估的多种真菌毒素检测方法奠定基础，为我国粮油产品中伏马毒素残留检测与限量制定提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

料理机（WBL25B36，广东美的生活电器制造有限公司）、多管旋涡振荡器（UMV-2，北京优晟联合科技有限公司）、高速冷冻离心机（5804R，德国艾本德公司）、高分辨质谱仪（Ultimate 3000-Q Exactive，美国赛默飞世尔科技公司）、加热板（EH35S，北京莱伯泰科仪器股份有限公司）、天平（ME802/02，梅特勒-托利多仪器有限公司）、数控超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）、0.22 μm滤膜（浙江哈迈科技有限公司）、超纯水仪（Milli-Q，美国密理博公司）。

色谱级甲醇（CH3OH）、乙腈(C2H3CN)、甲酸（HCOOH）、分析纯乙酸铵（CH3COONH4）（德国默克公司）；FB1、FB2和FB3标准品（规格1 mg，纯度≥98%，普瑞邦生物工程有限公司）。

1.2 样品采集与处理

国家农产品质量安全风险评估项目实施过程中，随机从河南玉米主产县采集160 份代表性玉米籽粒样品，每份样品的质量约为2 kg。将每份玉米样品按四分法缩分至500 g，全部用粉碎机磨碎至粒度小于1 mm，于密封袋中-20 ℃保存备用。

样品前处理：用天平准确称取5.00 g 的玉米样品于50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 乙腈-水-甲酸溶液（50:49:1）；用涡旋振荡器振荡约15 min，使其充分混匀；然后于高速冷冻离心机中以5 000 r/min 离心5 min；离心后取2.0 mL 上清液于干净的小烧杯中，将小烧杯置于45 ℃加热板上加热蒸干；随后向蒸干的小烧杯里加入2 mL 的乙腈-水溶液（1∶1），超声使其充分溶解；最后用0.22 μm 滤膜过滤，将滤液置于色谱进样小瓶中上机测定。

1.3 混合标准储备液与混合标准工作液的配制

混合标准储备液的配制：FB1、FB2和FB3标样分别加入1 mL 乙腈溶解，配制成质量浓度为1 g/L 的标准储备液。再分别吸取100 μL 的FB1、FB2和FB3标准储备液，混合均匀，用乙腈定容到10 mL，配制成质量浓度为10 mg/L 的混合标准储备液，密封于棕色试剂瓶中，于-20 ℃储存备用。

混合标准工作液的配制：（1）溶剂空白工作液。取适量体积的混合标准储备液，逐级稀释至终质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L。（2）玉米空白基质工作液。取玉米空白样品，按照1.2 中的前处理方法制备玉米空白基质溶液，然后按照溶剂空白工作液的配制方法配制。4 ℃储存，上机备用。

1.4 色谱条件

在色谱仪Ultimate 3000（美国赛默飞世尔科技公司）上进行，色谱柱为C18 反相色谱柱（Hypersil Gold，100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国赛默飞世尔科技 公 司）。 流 动 相A：CH3OH-H2O（98∶2）＋5 mmol/L CH3COONH4＋1% HCOOH；流 动 相B：CH3OH-H2O（2∶98）＋5 mmol/L CH3COONH4＋1%HCOOH；流速为0.20 mL/min，柱温设定为40 ℃，自动进样室设为室温，进样量为10 μL，仪器控制及数据处理通过Xcalibur 软件（美国赛默飞世尔科技公司）执行；流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.5 质谱分析条件

正离子扫描模式（ESI+），选择反应监测模式（SRM），喷雾电压3.0 kV，辅助气（N2）压力为10 Arb，鞘气（N2）压力为30 Arb，离子源加热温度为310 ℃，离子传输管温度为320 ℃，分辨率设为17 500 FWHM，自动增益值为2e5，最大注入时间为100 ms。

2 结果与分析

2.1 伏马毒素提取溶剂的优化

提取溶剂的选择直接影响回收率，广泛查阅检测伏马毒素的相关文献与标准，常用的伏马毒素提取溶剂为甲醇、乙腈、甲酸和水。考虑到伏马毒素为两性化合物，极性较强，增加提取液中极性溶剂的含量可能有助于改善伏马毒素的提取效率。甲醇、乙腈和水的极性大小顺序为水＞甲酸＞乙腈＞甲醇。综合考虑以上情况，排除对单一成分提取液（纯乙腈/甲醇）的考察，选择文献中报道的6 种真菌毒素提取组合溶剂进行验证分析及组分优化。这6种组合溶剂分别为甲醇-水（75∶25）、甲醇-水-甲酸（75∶24∶1）、乙腈-水（80∶20）、乙腈-水（50∶50）、乙腈-水-甲酸（50∶49∶1）、乙腈-水（40∶60）。优化过程中，每种提取溶剂做5 次平行试验。制备30 份玉米空白样品，分别加入1 mL的100 μg/L 伏马毒素混合标准液，混匀，然后分别用6种组合溶剂振荡提取，取5次平行试验的峰面积均值作为最终提取效果评判依据，试验结果如图1所示。从图1 可以看出，与其他混合溶剂比较，用乙腈-水-甲酸（50∶49∶1）混合溶剂提取3种伏马毒素FB1、FB2、FB3均能获得最大面积的色谱峰，因此选择乙腈-水-甲酸（50∶49∶1）混合溶剂作为最佳提取溶剂。

2.2 伏马毒素色谱分离条件的优化

2.2.1 流动相组分的优化 大多数液质联用检测方法以甲醇或乙腈为流动相，甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵作为常用的流动相调节剂。质谱检测器设置为正离子检测模式时，通常检测的母离子为[M+H]+离子。流动相中加酸主要是向化合物提供H+以提高该化合物在正离子模式下的离子化效率，同时有助于减少色谱峰拖尾，改善峰形；而流动相中添加挥发性铵盐有助于减少前延峰，起到改善峰形的作用[22]。对流动相A 和流动相B 进行优化，优化试验结果如图2 所示。从图2 可以看出，以流动相A：CH3OH-H2O（98∶2）＋5 mmol/L CH3COONH4＋1% HCOOH 和 流 动 相B：CH3OH-H2O（2∶98）＋5 mmol/L CH3COONH4＋1%HCOOH 为流动相，进行梯度洗脱（洗脱程序见表1），能够实现3 种伏马毒素的基线分离，出峰顺序依次为FB1、FB3和FB2。

2.2.2 梯度洗脱条件的优化 FB2和FB3属于同分异构体不易分离，优化试验设置了3 组梯度洗脱程序，洗脱程序a、b、c 的起始流动相比例（A∶B）分别为20∶80、30∶70、40∶60，详见表2。试验结果如图3所示，采用梯度洗脱程序a 时，以0.2 mL/min 的流速，在8 min内流动相A∶B的比例从开始的20∶80增加到100∶0，FB1、FB2、FB3之间的分离度最大只有0.5，无法实现基线分离。采用梯度洗脱程序b 时，由于起始流动相中A 流动相占比较大，即起始流动相中甲醇含量较高，有利于3种毒素的洗脱，从而缩短了保留时间；以0.2 mL/min 的流速，在8 min 内流动相A∶B 的比例从起始的30∶70 增加到90∶10，流动相比例变化相对较为温和，在此条件下，FB1、FB2、FB3实现了基线分离。进一步优化，采用梯度洗脱程序c 时，流动相A∶B 的起始比例为40∶60，在此条件下，虽然FB2和FB3色谱峰保留时间进一步缩短，但二者的分离度也随之降低，无法实现基线分离。综上所述，梯度洗脱程序b较为理想，作为最佳梯度洗脱条件。

表2 不同的梯度洗脱程序Tab.2 Different gradient elution procedures

2.3 伏马毒素质谱检测条件的优化

伏马毒素为两性化合物，本研究分别在正、负离子模式下对FB1、FB2和FB3进行了全扫质谱分析，结果显示，正离子模式下的信号强度更好，故采用正离子扫描模式。以[M+H]+作为母离子，选择色谱峰无干扰的特征碎片离子作为定量离子，其他离子为定性离子，优化3 种伏马毒素产生的二级质谱碎片的碰撞能量等参数，使其相应的分子离子峰和特征离子对峰的相对丰度达到最大，优化后的最佳伏马毒素质谱检测条件如表3 所示。分别选取352.315 0、336.320 3 和336.320 1 作 为FB1、FB2和FB3的定量离子。

表3 FB1、FB2和FB3的质谱参数Tab.3 Mass spectrum parameters for FB1，FB2 and FB3

2.4 建立检测方法的基质效应分析

准备适量玉米空白样品，按照方法1.2 前处理制备玉米空白基质混合标准储备液，依次稀释成质量浓度为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/L的系列标准溶液，以定量离子峰面积（Y）对质量浓度（X，μg/L）绘制标准曲线，相应的线性回归方程和相关系数见表4。结果表明，在玉米空白基质工作液和溶剂空白工作液中，FB1、FB2和FB3在1～1 000 μg/L 线性关系均良好。为避免玉米空白基质效应对后续试验的影响，均采用玉米空白基质绘制标准曲线，进行外标法定量校正。

表4 在2种工作液中伏马毒素的线性回归方程Tab.4 Linearity equation of fumonisins in two fluids

2.5 建立检测方法的检出限及定量限

向空白样品中添加FB1、FB2和FB3混合标准液，在最佳试验条件下进行测定，分别以3 倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。检测结果如表5 所示，FB1的LOD、LOQ 分别为0.16 μg/kg 和0.52 μg/kg，FB2的LOD、LOQ 分别为0.16 μg/kg 和0.52 μg/kg，FB3的LOD、LOQ分别为0.31 μg/kg和1.01 μg/kg。

表5 伏马毒素的检出限及定量限Tab.5 LOD and LOQ for fumonisins μg/kg

2.6 建立检测方法的回收率与精密度

选定一个空白玉米试样进行加标回收试验，选择50、1 000、2 000 μg/kg 分别为低、中、高3 个添加量，每个添加量设6个平行，考察本研究建立的轻简化液质联用法测定FB1、FB2和FB3的平均回收率和精密度，结果如表6 所示。由表6 可知，3 种伏马毒素的回收率均在77.72%～102.79%，对应的相对偏差在1.07%～8.92%。由此说明，本研究建立的轻简化液质联用法可以用于玉米中FB1、FB2和FB3的准确测定。

表6 建立检测方法的回收率与精密度Tab.6 Investigation of the recovery and precision of the investigated method

2.7 玉米样品验证分析

为了进一步验证本研究建立的轻简化液质联用法的可行性，对2020 年160 份来自汝南县、夏邑县、郸城县、方城县和延津县等玉米主产地的风险评估样品进行伏马毒素污染情况风险评估验证分析，结果显示，160份玉米样品伏马毒素检出率高达82.5%，伏马毒素（FB1＋FB2＋FB3）含量为4.17～12 056.15 μg/kg，其中17 份超过国际食品法典委员会（CAC）限量（4 mg/kg），超标率达10.63%。通过对该批次玉米样品的成功分析，进一步验证了本研究建立的轻简化液质联用法在国家农产品质量安全风险评估中具有一定的应用前景。

3 结论与讨论

本研究建立的轻简化液质联用法在1～1 000 μg/L 的质量浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数r＞0.999。加标回收试验结果显示，50、1 000、2 000 μg/kg 3 个 加 标 量 的 回 收 率 为77.72%～102.79%，相对标准偏差为1.07%～8.92%。与已经报道的液相色谱法、气相色谱法、气质联用法、液质联用法等伏马毒素检测方法相比，本研究建立的轻简化液质联用法免去了免疫亲和柱、阴离子固相萃取柱的使用，具有操作简单、稳定可靠、灵敏度高、检测成本低等优点，且可以实现玉米中FB1、FB2、FB33 种伏马毒素的同时定量检测。此外，通过对160份玉米风险评估样品的分析，进一步验证了该方法的可靠性。

玉米在生长、收获和储藏的过程中极易受伏马毒素污染[23]，对人畜造成一定种属、性别差异性毒害。连续多年的国家玉米产品质量安全风险评估结果显示，玉米受伏马毒素污染相当普遍，以河南、山东为例，2020 年玉米伏马毒素超标率超过40%，应当引起监管部门的重视。因此，持续开展玉米伏马毒素污染风险评估，及时掌握全国大宗粮油农产品质量安全状况，加强监管具有重要意义。建议尽快制定我国玉米中伏马毒素限量，加快抗性玉米品种的选育，强化玉米绿色栽培和储藏技术的培训与示范。本研究建立的轻简化液质联用法为大批量样品中伏马毒素筛查分析与风险评估提供了可选技术，为我国大宗粮油产品中伏马毒素污染监测与限量制定提供了技术支撑。