核酸检测反应性献血者归队方案探讨*

任亚娜 周国平

我国从2010年起在血站系统逐渐开始血液筛查NAT（nucleic acid testing，NAT）试点工作，目前已基本实现了全面覆盖，它在血液筛查方面的优势也越来越明显。但是与酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）一样，用高灵敏度的核酸筛查试剂检测健康的献血者，必定存在假反应性结果。假反应性的原因包括试剂、献血者自身和技术等导致检测信号非正常上升的因素，乙肝、丙肝等核酸筛查试剂的假反应性结果，国内外均有文章报道[1-3]。基于有效保护献血者的权利，珍惜有限的血液资源，欧盟、英国、美国均已相继制定了核酸反应性献血者屏蔽与归队指南[4-8]。我国已制定团体标准血液筛查反应性献血者归队指南[9]，但核酸反应性献血者的相关方案还没有纳入归队指南中，需要进一步探讨和研究。本研究通过对NAT反应性献血者再召回进行检测，并增补化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA），初步确定归队结果判断规则，设计了核酸反应性献血者归队方案供开展归队工作的血站探讨参考。

资料与方法

1 材料

1.1 研究对象：筛选上海市血液中心2012年～2017年ELISA无反应性、HBV-DNA、HCV-RNA、HIVRNA反应性献血者，间隔至少6个月后进行召回，每轮召回收集血液样本15 mL，分别采集在2支酶免管和1支核酸管中。

1.2 试剂：乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗原抗体、梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）（上海科华生物工程股份有限公司，Diasorin S.p.A. UK Branch，Ortho-Clinical Diagnostics, Inc，厦门新创科技有限公司，珠海丽珠试剂股份有限公司）以及相关血清（液体）标准物质（北京康彻思坦生物技术有限公司）。NAT试剂：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂（PCR-荧光法）（Roche Molecular Systems, Inc）以及相关质控品（北京康彻思坦生物技术有限公司）。HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe、Anti-HCV、Anti-HIV化学发光免疫分析法试剂以及相关质控品（Roche Molecular Systems, Inc）。

1.3 设备：Microlab STAR全自动加样系统（HAMILTON BonaduzAG）；Freedom Evo Clinical免疫分析加样系统（Tecan Schweiz AG）；MicrolabF.A.M.E. 全自动酶免分析仪（HAMILTON Bonaduz AG）；COBAS AmpliPrep全自动核酸分离纯化系统 （罗氏诊断产品（上海）有限公司）；COBAS TaqMan系统（罗氏诊断产品（上海）有限公司）；COBAS e411全自动电化学发光免疫分析仪（罗氏诊断产品（上海）有限公司）。

2 方法

2.1 ELISA和NAT（PCR-荧光法）：严格按照ELISA试剂盒说明书要求对血液标本进行乙肝病毒抗原、丙肝病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗原抗体和梅毒螺旋体抗体检测。四个项目都利用两种厂家的试剂，进行两遍检测以及反应性双孔复检。严格按照乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒说明书对标本进行乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA、人类免疫缺陷病毒RNA单检。室内质控结果符合检验科室内质控要求，并按照血站技术操作规程判断ELISA和NAT结果。

2.2 CLIA（电化学发光法）：严格按照试剂盒说明书进行全自动电化学发光免疫分析仪仪器校正及罗氏配套定标液进行试剂的定标，乙肝两对半（HBsAg、HBeAg、Anti-HBs、Anti-HBc、Anti-HBe）、丙肝病毒抗体（Anti-HCV）、人类免疫缺陷病毒抗体（Anti-HIV）共7个项目定标完成后进行相应项目的检测。质控品分析程序，采用相应项目配套质控品监测实验的可控。

结 果

1 第一轮召回ELISA和NAT结果 第一轮共召回42人，其中HBV-DNA反应性献血者37人， HCV-RNA反应性献血者4人，HBV-DNA反应性且HCV-RNA反应性献血者1人。第一轮召回的献血者样本先通过血清学检测方法（两遍ELISA）和核酸检测方法（NAT单检）进行归队检测标志物（HBV、HCV、HIV和TP）的检测。41位献血者中检测结果为ELISA无反应性/NAT反应性的15人（占64.3%），ELISA无反应性/NAT无反应性的26人（占35.7%）。其中HBV-DNA反应性且HCV-RNA反应性的该位献血者第一轮召回检测结果为ELISA 无反应性/NAT 无反应性（表1）。

表1 核酸反应性献血者第一轮召回检测结果

2 第一轮召回CLIA结果 第一轮召回检测为ELISA无反应性/NAT无反应性的献血者（27人），再采用CLIA检测乙肝五项、Anti-HCV和Anti-HIV，结果如下。9人（占33.3%）化学发光结果为Anti-HBc反应性/Anti-HBe反应性、14人（占51.9%）化学发光结果为Anti-HBc反应性、4人（占14.8%）CLIA结果为7项检测全部为无反应性（表2、表3）。其中HBVDNA反应性且HCV-RNA反应性的该位献血者化学发光结果为Anti-HBc反应性。

表2 ELISA无反应性/NAT无反应性献血者化学发光法检测结果

表3 HBV-DNA、HCV-RNA反应性献血者化学发光检测结果

3 第二轮召回检测结果 至少间隔6个月进行第二轮召回，召回的18人第一轮检测为ELISA无反应性/NAT无反应性/CLIA无反应性的1人、 ELISA无反应性/NAT无反应性/CLIA反应性的10人、 ELISA无反应性/NAT反应性/CLIA 反应性的7人。召回后进行两遍ELISA和NAT单检，而且进行了CLIA试验，结果见表4。其中有1人第一轮检测结果ELISA无反应性 /NAT无反应性/CLIA反应性，而第二轮检测结果HBV-NAT转为反应性；1人第一轮检测结果ELISA无反应性/NAT反应性/CLIA反应性，而第二轮检测结果为NAT无反应性。其余的第一轮和第二轮检测结果一致。

表4 第二轮召回检测结果

4 归队方案的初步设计 根据实验结果，初步设计了HBV NAT和HCV NAT反应性献血者归队方案：第一轮召回检测为ELISA反应性/NAT反应性和ELISA反应性/NAT无反应性的献血者，两种ELISA试剂均为反应性的建议永久屏蔽；ELISA无反应性/NAT反应性献血者暂时屏蔽，屏蔽一段时间（如6个月）可进入第二轮归队流程；ELISA无反应性/NAT无反应性献血者若CLIA中任一项反应性（除Anti-HBs）则建议永久屏蔽；ELISA无反应性/NAT无反应性献血者CLIA所有项目均无反应性献血者建议可以归队（图1）。第二轮召回检测ELISA、NAT和CLIA若有任一项反应性（除Anti-HBs）建议永久屏蔽；召回检测结果均为无反应性的献血者，建议可以归队（图2）。

图1 HBV、HCV NAT反应性献血者第一轮归队流程图

图2 HBV、HCV NAT反应性献血者第二轮归队流程图

讨 论

核酸反应性的血液报废，核酸反应性献血者永久屏蔽，在保护受血者的安全起到积极的作用，但随着核酸检测在血筛领域的广泛应用，也有许多献血者因核酸假反应性结果被永久屏蔽。因此，核酸反应性献血者归队问题也渐渐引起了国内外血站的关注。在广泛参考欧盟、美国、英国等发达国家的相关标准，并且充分考虑我国的国情，制定核酸反应性献血者屏蔽或召回流程，为开展相关工作提供一个技术途径。我国关于NAT反应性献血者归队问题及方案目前研究的还很少，大多只有对献血时采集的样本进行进一步的实验研究[10-11]。有血站已在进行献血者归队工作，但未进行相应的如化学发光等补充试验[12-13]。

本研究初步设计HBV、HCV NAT反应性献血者归队方案：召回符合条件的献血者，采集标本后采用原来的以及更为灵敏的检测方法（CLIA）检测。本研究采取原来的ELISA检测试剂和方法以及核酸检测单检模式。实验结果显示，64.3%的献血者第一轮召回检测结果为ELISA无反应性/NAT无反应性，可能存在上次献血筛查假反应性，然后通过CLIA作为补充实验。第一轮召回检测结果为ELISA无反应性/NAT无反应性进行化学发光实验，85.2%为Anti-HBc反应性和/或Anti-HBe反应性，且结果显示第一轮Anti-HBc和/或Anti-HBe反应性者第二轮仍为反应性。有文章报道，将乙肝ELISA无反应性/NAT反应性献血者标本，进一步分析发现大多为HBV隐匿性感染[14-15]。隐匿性乙肝感染发生机制与乙型肝炎病毒变异密切相关，是输血传播乙肝病毒的潜在危险；Anti-HBe反应性标本，可能为近期感染或急性恢复期或感染已恢复。因此，建议ELISA无反应性/NAT无反应性/CLIA反应性献血者在第一轮永久屏蔽。

本研究中有1例ELISA无反应性/HBV-NAT反应性献血者第一轮召回检测结果为ELISA无反应性/HCV-NAT反应性且ALT不合格，首先怀疑是否存在HCV感染窗口期。6个月后又召回进行检测，ELISA无反应性/NAT无反应性、ALT正常，考虑可能为献血者自身原因导致的检测信号的假性升高。另外，结果显示4例ELISA无反应性/HCV-RNA反应性的献血者化学发光检测结果有1例Anti-HBc/Anti-HBe反应性、1例Anti-HBc反应性，考虑是否有重叠感染或因献血者自身原因导致的检测信号的假性升高。为了血液安全考虑，建议核酸反应性献血者若化学发光乙肝五项或丙肝抗体有任一项反应性（除Anti-HBs）则屏蔽。化学发光实验中14.8%为所有项目均无反应性，可准许其解除屏蔽，再次参加献血的程序。

35.7 %献血者第一轮召回检测仍为ELISA无反应性/NAT反应性，建议6个月后进入第二轮归队检测。第二轮归队检测为ELISA无反应性/NAT无反应性且CLIA无反应性的献血者，建议也可回归献血者队伍；若ELISA、NAT或CLIA任一项有反应性，建议永久屏蔽。按照本研究初步设计的NAT反应性献血者归队流程，本次的研究对象42人中4人（占9.5%）的NAT反应性献血者召回后，检测结果符合归队条件，可解除屏蔽回归献血者队伍。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突