纤溶酶原激活物抑制因子1在腹膜透析患者中的表达及其对腹膜纤维化的影响

苏 瑞,梅春丽,李玉萍,李 铭,李 婷,赵 欣,卢家美,邹晓荣*

(1中国人民解放军空军第九八六医院肾脏病科,西安 710054;2中国人民解放军空军第九八六医院内分泌科;3陕西省人民医院特诊科;4西安交通大学第二附属医院肾病内科;*通讯作者,E-mail:Zouxiaorong986@163.com)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)患者的一种有效的肾脏替代疗法。然而,长期暴露于各种不利因素(如生物不相容的腹膜透析溶液、尿毒症、腹膜炎和基础慢性肾脏疾病),会导致腹膜结构的改变。这些变化包括间皮细胞的丢失、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生、血管生成的诱导等,从而引起腹膜纤维化和超滤功能下降,最终导致腹膜透析失败。因此,寻求有效的防治腹膜纤维化的策略是非常重要的[1]。

EMT是上皮细胞失去其特有的上皮特性而获得间充质细胞特性的过程。许多生长因子和细胞因子参与了这一过程。其中,转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)已被证实在腹膜纤维化的发生发展中起主导作用[2-5]。TGF-β1通过激活Smad信号通路诱导腹膜纤维化[6]。此外,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的激活也参与了这些过程[6]。STAT3是重要的转录因子,STAT3被激活后参与腹膜纤维化过程[7]。

纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,并且是尿激酶型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)的主要抑制剂[8-12],此外还进一步抑制下游基质金属蛋白酶活化[13-15]。本课题组前期研究中发现,PAI-1参与调节细胞外基质(ECM)形成,牛蒡子苷元减轻腹膜透析中的纤维化的机制与抑制PAI-1的表达有关[16]。

目前,PAI-1在腹膜纤维化中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示PAI-1在腹膜透析患者中的表达模式及其功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

体质量为20-25g左右的C57/BL6小鼠由西安交通大学实验动物中心提供[SYXK(陕)2020-005]。抗PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、EGFR、p-EGFR、Acetyl α-tubulin和β-actin的抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗和生物素标记的二抗购自美国Cell Signaling Technologies公司。抗Collagen Ⅰ、E-cadherin和α-SMA抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。人腹膜间皮细胞(HPMCs)购自美国ATCC。DMEM高糖培养基购自美国Sigma-Aldrich公司。Opti-MEM培养液购自美国Gibco公司。TGF-β1购自派普泰克生物科技(苏州)有限公司。靶向PAI-1的小干扰RNA(si-PAI-1)及阴性对照siRNA(si-NC)由上海吉玛制药技术有限公司合成。RIPA裂解液和蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术研究所。苏木精伊红(HE)染色和Masson三色染色试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 研究对象

纳入2016年7月至2018年7月我院腹透中心长期规律随访的30例腹透患者(腹膜透析组)。患者年龄大于18岁且透析龄满2年;排除患有肿瘤、感染性疾病、结缔组织疾病、心脑血管等脏器衰竭者。收集记录所有纳入患者性别、年龄、基础疾病、透析龄。另外,纳入基线数据匹配的30例终末期肾病患者(终末期肾病组)。终末期肾病组患者是拟行腹膜透析管置管术者。均在手术中采集腹膜标本,大小约18 mm×3 mm,选取前腹壁新切开的壁层腹膜。本研究通过空军军医大学第986医院伦理委员会批准,所有入选患者均知情同意。

1.3 HPMCs细胞的处理和分组

人腹膜间皮细胞(HPMCs)在含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基中培养,培养环境为5% CO2、37 ℃。然后细胞做如下分组处理:①为了验证TGF-β1对HPMCs中PAI-1蛋白表达的影响,将细胞分为正常对照组和TGF-β1组。正常对照组细胞正常培养,TGF-β1组细胞用10 ng/ml TGF-β1培养24 h,通过Western blot检测HPMCs中PAI-1的蛋白表达。②为了下调PAI-1的表达,将细胞分为正常对照组、si-NC组和si-PAI-1组。正常对照组细胞不进行转染,si-NC组和si-PAI-1组细胞分别用si-NC和si-PAI-1转染,通过Western blot检测HPMCs中PAI-1的蛋白表达。③为了考察PAI-1对TGF-β1诱导的HPMCs中EMT、TGF-β1/Smad3信号通路和EGFR/STAT3信号通路的影响,将细胞分为3组:正常对照组、TGF-β1+si-NC组和TGF-β1+si-PAI-1组。正常对照组细胞正常培养,TGF-β1+si-NC组和TGF-β1+si-PAI-1组细胞分别用si-PAI-1及si-NC转染后,在0.5% FBS DMEM饥饿HPMCs 24 h,然后将其在10 ng/ml TGF-β1中培养24 h。通过Western blot检测腹膜间皮细胞中PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、Collagen Ⅰ、E-cadherin、α-SMA、EGFR、p-EGFR和Acetyl α-tubulin的蛋白表达。

1.4 HPMCs的si-PAI-1及si-NC转染

将HPMCs接种于不含抗生素的30%-40%融合培养基中培养24 h,然后用lipofectamine 2000将si-PAI-1及si-NC(50 nmol/L)转染HPMCs。转染24 h后,再用TGF-β1(10 ng/ml)处理24 h,然后收集细胞进行实验。

1.5 腹膜纤维化小鼠模型的建立及动物分组处理

小鼠每天腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液,连续注射28 d,建立腹膜纤维化模型[17]。将小鼠随机分为3组,每组12只:正常对照组、腹膜纤维化+si-NC组(PF+si-NC组)和腹膜纤维化+si-PAI-1组(PF+si-PAI-1组)。正常对照组小鼠腹腔注射3 ml生理盐水及300 μl Opti-MEM;PF+si-PAI-1组小鼠腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液及si-NC(0.1 mg/kg,溶于300 μl Opti-MEM);PF+si-PAI-1组小鼠腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液及si-PAI-1(0.1 mg/kg,溶于300 μl Opti-MEM)。28 d后处死所有小鼠,取壁层腹膜作进一步分析。

1.6 Western blot检测蛋白的表达

将腹膜组织用匀浆器匀浆,然后在RIPA裂解液中裂解,并在15 000 r/min离心15 min,取上清。用蛋白提取试剂盒提取蛋白。用BCA测定试剂盒测蛋白质浓度。取150 μg蛋白煮沸变性,在12% SDS-PAGE凝胶上电泳并转移到PVDF膜上。在5%的牛血清白蛋白中封闭1 h后,将PVDF膜与PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、Collagen Ⅰ、E-cadherin、α-SMA、EGFR、p-EGFR、Acetyl α-tubulin和β-actin一抗(1 ∶2 000)在4 ℃孵育过夜。然后,将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在37 ℃下孵育1 h。使用ECL检测试剂显影,并使用Image J软件计算条带强度,β-actin作为内参。

1.7 小鼠腹膜组织的HE染色和Masson三色染色

将小鼠腹膜组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后切成4 μm厚切片。根据说明书对组织进行HE染色和Masson三色染色。然后置于显微镜下观察(放大倍数为×200)。

1.8 免疫组织化学染色检测患者和小鼠的腹膜切片中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA的表达

将患者和小鼠的腹膜切片脱蜡和水化后,用3% H2O2浸泡15 min,微波炉中加热10 min。切片用山羊血清在37 ℃封闭30 min。将切片与一抗PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA(1 ∶500稀释)在4 ℃过夜孵育。然后与生物素标记的二抗在37 ℃孵育30 min,再与过氧化物酶试剂37 ℃孵育30 min,然后DAB在37 ℃孵育5 min。苏木素复染核5 min。常规脱水、透明、封片后,用ImageJ软件计算阳性细胞率。

1.9 统计学分析

使用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析,数据表示平均值±标准差,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析及LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腹膜透析患者和终末期肾病患者腹膜组织中PAI-1的表达

免疫组化染色显示,与终末期肾病组比较,腹膜透析组腹膜组织中的PAI-1阳性率显著升高(P<0.05,见图1)。Western blot显示,与终末期肾病组比较,腹膜透析组腹膜组织中的PAI-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05,见图1)。

图1 腹膜透析患者和终末期肾病患者腹膜组织中PAI-1的表达Figure 1 PAI-1 expression in peritoneal tissues of peritoneal dialysis patients and end-stage renal disease patients

2.2 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT的影响

与正常对照组比较,TGF-β1组的腹膜间皮细胞中PAI-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05,见图2)。转染si-PAI-1下调了腹膜间皮细胞中PAI-1的蛋白表达(P<0.05,见图3)。

与正常对照组比较,TGF-β1+si-NC组腹膜间皮细胞中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白相对表达量显著升高,E-cadherin显著降低(P<0.05,见图4)。与TGF-β1+si-NC组比较,TGF-β1+si-PAI-1组腹膜间皮细胞中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白相对表达量显著降低,E-cadherin显著升高(P<0.05,见图4)。

2.3 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞中TGF-β1/Smad3信号通路的影响

与正常对照组比较,TGF-β1+si-NC组腹膜间皮细胞中p-Smad3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),Acetyl α-tubulin显著降低(P<0.05);与TGF-β1+si-NC组比较,TGF-β1+si-PAI-1组腹膜间皮细胞中p-Smad3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),Acetyl α-tubulin显著升高(P<0.05)。三组间Smad3蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05,见图5)。

与正常对照组比较,*P<0.05图2 TGF-β1对腹膜间皮细胞中PAI-1蛋白表达的影响Figure 2 The effect of TGF-β1 on the expression of PAI-1 protein in peritoneal mesothelial cells

与正常对照组比较,*P<0.05图3 腹膜间皮细胞中si-PAI-1的转染效率Figure 3 Transfection efficacy of si-PAI-1 in peritoneal mesothelial cells

2.4 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞中EGFR/STAT3信号通路的影响

与正常对照组比较,TGF-β1+si-NC组腹膜间皮细胞中p-EGFR和p-STAT3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与TGF-β1+si-NC组比较,TGF-β1+si-PAI-1组腹膜间皮细胞中p-EGFR和p-STAT3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。三组间EGFR和STAT3蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05,见图6)。

与正常对照组比较,*P<0.05;与TGF-β1+si-NC组比较,#P<0.05图4 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞中PAI-1、Collagen Ⅰ、E-cadherin和α-SMA蛋白表达的影响Figure 4 The effects of PAI-1 on the expression of PAI-1, Collagen Ⅰ, E-cadherin and α-SMA protein in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

与正常对照组比较,*P<0.05;与TGF-β1+si-NC组比较,#P<0.05图5 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞中TGF-β1/Smad3信号通路的影响Figure 5 The effects of PAI-1 on the TGF-β1/Smad3 signaling pathway in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

与正常对照组比较,*P<0.05;与TGF-β1+si-NC组比较,#P<0.05图6 PAI-1对TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞中EGFR/STAT3信号通路的影响Figure 6 The effects of PAI-1 on the EGFR/STAT3 signaling pathway in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

2.5 PAI-1对高糖透析液诱导的腹膜纤维化小鼠腹膜纤维化的影响

HE染色和Masson三色染色结果显示,与正常对照组比较,PE+si-NC组腹膜组织厚度、炎性细胞浸润和ECM沉积明显增加;与PE+si-NC组比较,PE+si-PAI-1组的上述病理变化明显减轻(见图7)。

图7 小鼠腹膜组织的HE染色和Masson三色染色 (×200)Figure 7 HE staining and Masson trichrome staining of mouse peritoneal tissue (×200)

免疫组化染色结果显示,与正常对照组比较,PE+si-NC组腹膜组织的E-cadherin阳性率显著降低,α-SMA显著增加(P<0.05,见图7);与PE+si-NC组比较,PE+si-PAI-1组腹膜组织的E-cadherin阳性率显著增加,α-SMA显著降低(P<0.05,见图8)。

与正常对照组比较,*P<0.05;与PE+si-NC组比较,#P<0.05图8 小鼠腹膜组织E-cadherin和α-SMA的免疫组化染色 (×200)Figure 8 Immunohistochemical staining of E-cadherin and α-SMA in mouse peritoneal tissue (×200)

3 讨论

多项研究报道了PAI-1在肺、肝、肾、心脏和血管纤维化中的作用。PAI-1的表达在人纤维化肺和博来霉素诱导的小鼠肺中均升高[18]。PAI-1对肺纤维化的刺激作用的一个可信的解释是,它通过抑制纤溶酶的生成,进而促进过量的纤维蛋白积累。Bergheim等[19]报道,PAI-1缺陷型小鼠的胆管结扎引起的早期肝损伤和炎症明显减弱。Wang等[20]证明,与野生型小鼠相比,PAI-1缺陷型小鼠肝脏纤维化减少,tPA和MMP9活性增加。PAI-1在正常肾脏中低水平表达,但在几种急性和慢性肾脏疾病中均高水平表达[21]。PAI-1被证明可以通过减少间质性成肌纤维细胞和巨噬细胞的数量来预防单侧输尿管梗阻介导的肾纤维化[22]。PAI-1缺乏也会减弱肾脏中的间质胶原沉积[23]。以前的研究已经证明,心肌梗死后心肌细胞中PAI-1表达的增加有助于心肌纤维化的进展。在心肌梗死模型中,PAI-1缺乏与较少的心脏纤维化有关[24]。然而,目前缺乏PAI-1在腹膜透析相关腹膜纤维化方面的研究。

腹膜纤维化是长期腹膜透析患者发生的主要并发症之一,其特点是肌成纤维细胞数量增加和间质ECM沉积。大多数体外和体内研究都支持受损的间皮细胞是肌成纤维细胞的来源。在腹膜纤维化过程中,大约17%的肌成纤维细胞来源于间皮细胞,受损的间皮细胞获得了产生多种细胞因子和生长因子的能力,这些因子可以刺激常驻成纤维细胞的激活和增殖,从而产生更多的ECM蛋白,促进腹膜纤维化的发展[25]。抑制EMT或局部成纤维细胞向肌成纤维细胞分化可能会减缓肾纤维化的发展,因为间皮细胞和肌成纤维细胞都能产生Collagen Ⅰ,Collagen Ⅰ是ECM的主要成分,本研究结果表明与未进行腹膜透析的患者相比,腹膜透析后PAI-1被激活。PAI-1的激活在腹膜间皮细胞的EMT和成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化过程中起着至关重要的作用。通过转染siRNA沉默PAI-1后,TGF-β1诱导的间皮细胞中E-cadherin(上皮细胞标志物)明显下调,而α-SMA和Collagen Ⅰ(间质细胞的标志)明显上调,从而抑制了EMT过程及随后的纤维化。

本研究结果显示,下调PAI-1可显著抑制TGF-β1诱导的间皮细胞Smad-3的磷酸化,通过阻断TGF-β1/Smad信号通路来预防腹膜纤维化。目前,PAI-1如何促进TGF-β1/Smad信号的激活仍不清楚。以前的研究表明,腹膜损伤是由Smad-3依赖机制介导的[26]。Smads与微管的结合使Smads处于非活跃期,TGF-β1可以触发Smads从微管释放并随后磷酸化[27]。因此,PAI-1对Acetyl α-tubulin的脱乙酰化可能改变微管功能,影响Smad磷酸化。本研究中PAI-1对Acetyl α-tubulin的上调也证实了这一推论。

间皮细胞可能通过产生EGF和CTGF促进腹膜纤维化。这些生长因子以旁分泌方式靶向间皮,诱导成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞转化[28]。抑制PAI-1也可能通过靶向EGFR信号转导而减轻腹膜纤维化。最近的研究表明,EGFR是肾和腹膜纤维化的关键介质[6]。在本研究中,抑制PAI-1导致培养的间皮细胞中EGFR的磷酸化水平降低。抑制PAI-1也降低了EGFR下游分子STAT3的磷酸化。其他人的研究已经证明EGFR/STAT3通路的激活与腹膜纤维化的进展有关[29]。另外,本研究证明了下调PAI-1抑制了STAT3的磷酸化,这个转录因子对各种炎性细胞因子/趋化因子的表达和产生至关重要[30]。腹膜纤维化炎症的特征是细胞因子/趋化因子的大量表达和巨噬细胞的浸润[31]。PAI-1可能通过调节关键转录因子来调控这些细胞因子/趋化因子的表达,从而减轻纤维化。

综上所述,本研究首次在体内外研究中证明了下调PAI-1可抑制腹膜纤维化的发展,推测这种抗纤维化机制可能与TGF-β1/Smad3和EGFR/STAT3信号通路的失活有关。然而,在接下来的研究中还需要进行信号通路的阻断/增强实验来验证这一推论。总之,PAI-1可能是预防和治疗腹膜纤维化的潜在靶标。