败酱草对对乙酰氨基酚诱导的大鼠药物性肝损伤的保护作用

唐文诚何 清宋大萍沈政洪王继生*

(1.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000；2.绵阳市第三人民医院·四川省精神卫生中心，四川 绵阳 621000)

药物引起的肝损伤是急性肝衰竭的主要原因，这是由于人体中累积的药物代谢为有毒物质，并有助于产生严重的氧化应激，炎症和细胞凋亡，从而诱发肝细胞坏死最终损害肝[1]。尽管药物性肝损伤临床发病率相对较低，但在发达国家，它仍然是急性肝衰竭的常见原因[2]。对乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)是世界上最受欢迎和最安全的止痛药之一，然而由于其广泛的可用性，它经常涉及有意或无意的过量使用，可导致严重的肝损伤，目前广泛用于临床建立药物性肝损伤动物模型[3－4]。

近年来的研究表明，由于中草药具有治疗作用，被认为是改善肝和其他疾病的潜在药物[5]。败酱草(herba patriniae)是多年生中草药，含有氨基酸、维生素、矿物质和生物碱等有益成分，具有抗氧化、抗菌、消除血瘀，促进肝细胞再生和减轻焦虑的作用[6]。已有研究表明白花败酱草醇提物通过抗氧化及抑制肝细胞凋亡而改善四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤[7]，说明败酱草的肝保护作用。但败酱草对药物性肝损伤的具体作用机制尚未见报道，本文旨在探究败酱草对对乙酰氨基酚诱导的大鼠药物性肝损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只SD清洁级大鼠，雄性，12周龄，体重280±10 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]，动物合格证编号:11400700183999，常规饲喂。所有大鼠均饲养于西南医科大学SPF动物房[SYXK(川)2018-065]。本研究经绵阳市第三人民医院伦理委员会批准(IACUC-2020D127-21)，实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

败酱草(121271-201201)、对乙酰氨基酚(100018-201610)购自中国食品药品检定研究院；联苯双酯(T3273)购自美国Target Molecule Corp公司；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(C0105M)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H＋L)(A0208)购自上海碧云天生物技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)测试盒(C009-2-1)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)测试盒(C010-2-1)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒(A059-1-1)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(A003-1-2)、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(A001-3-2)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒(A005-1-2)购自南京建成生物工程研究所；TNF-α(JK-(a)-0016)、IL-6(JK-(a)-1498)、IL-1β(JK-(a)-E06517)ELISA测试盒购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及分组

将大鼠随机分为6组:对照组、模型组、败酱草低剂量组、败酱草中剂量组、败酱草高剂量组、联苯双脂组，每组10只。除对照组外，其余各组参照王茜等[8]方法每日灌胃对乙酰氨基酚1000 mg/kg，每日1次，连续30 d复制肝损伤模型。造模同时，败酱草低剂量组、败酱草中剂量组和败酱草高剂量组每日灌胃败酱草4、8、16 g/kg[9]，联苯双脂组每日灌胃联苯双脂0.3 g/kg[10]，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，连续30 d。

1.3.2 肝脏指数

最后1次灌胃12 h后，测量各组大鼠重，处死所有大鼠，测量体重，计算肝脏指数。肝脏指数＝肝重量(g)/体重(g)×100%。

1.3.3 HE染色

将各组大鼠肝组织于4%多聚甲醛中固定72 h，随后对已固定的肝组织置于20%乙二胺四乙酸中进行脱钙处理，将样品在梯度浓度的乙醇中脱水并包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成5 mm切片，于室温下进行苏木精染色10 min，伊红染色2 min。使用光学显微镜观察肝组织病理学变化。

1.3.4 血清生化指标

按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定血清中ALT、AST和ALP水平。ALT、AST在510 nm处测OD值，AKP在520 nm处测OD值。

1.3.5 ELISA

取各组大鼠肝组织，滴入含有蛋白酶抑制剂的冰缓冲液，制作成匀浆液，离心收集上清液。按照ELISA试剂盒说明书测定肝组织上清液TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。

1.3.6 氧化应激

按照试剂盒说明书，采用酶标仪测定肝组织匀浆中SOD含量，采用可见分光光度计测定丙二醛MDA、GSH-Px含量。SOD在450 nm处测OD值，MDA在532 nm处测OD值，GSH在412 nm处测OD值。

1.4 统计学方法

用统计软件SPSS 19.0对所有实验数据进行统计分析，组间差异采用t检验或单因素方差分析进行检验。结果以平均数±标准差(±s)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 败酱草降低对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝脏指数

与对照组相比较，模型组肝脏指数显著升高(P<0.05)。与模型组相比较，败酱草中、高剂量组和联苯双酯组肝脏指数显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝脏指数的影响(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表1 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝脏指数的影响(±s，n＝10)Table 1 Effect of herba patriniae on hepatic index in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

组别Groups剂量(g/kg)Dose肝脏指数(%)Liver index对照组Control gourp 0 2.8±0.4模型组Model group 0 4.5±0.9*败酱草低剂量组Low dose herba patriniae group 4 3.2±0.2＃败酱草中剂量组Medium dose herba patriniae group 8 3.3±0.3＃败酱草高剂量组High dose herba patriniae group 16 3.1±0.3＃联苯双酯组Bifendatatum group 0.3 3.2±0.3＃

2.2 败酱草改善对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝组织病理损伤

对照组肝细胞排列整齐，结构完整。模型组细胞排列紊乱，有明显出血，大量炎性细胞浸润。败酱草中、高剂量组和联苯双酯组细胞排列较整齐，出血明显减少，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠肝组织病理损伤的影响Figure 1 Effect of herba patriniae on pathological injury of rat liver tissue induced by paracetamol-induced drug-induced liver injury

2.3 败酱草降低对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠AST、ALT、ALP水平

与对照组相比较，模型组AST、ALT、ALP水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比较，败酱草低、中、高剂量组和联苯双酯组AST、ALT、ALP水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠AST、ALT、ALP水平的影响(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表2 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠AST、ALT、ALP水平的影响(±s，n＝10)Table 2 Effects of herba patriniae on AST，ALT and ALP levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

组别Groups剂量(g/kg)Dose天门冬氨酸氨基转移酶(U/L)AST丙氨酸氨基转移酶(U/L)ALT碱性磷酸酶(U/L)ALP对照组Control gourp 0 187.34±27.31 31.80±5.12 115.74±8.53模型组Model group 0 342.66±15.77* 104.67±18.36* 158.47±14.25*败酱草低剂量组Low dose herba patriniae group 4 310.38±12.03 94.51±18.79 145.33±12.86败酱草中剂量组Medium dose herba patriniae group 8 287.32±10.58＃ 77.36±14.07＃ 132.34±9.85＃败酱草高剂量组High dose herba patriniae group 16 230.78±11.57＃ 68.45±10.75＃ 112.53±15.31＃联苯双酯组Bifendatatum group 0.3 227.86±10.91＃ 65.18±10.17＃ 110.76±9.34＃

2.4 败酱草降低对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平

与对照组相比较，模型组TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比较，败酱草低、中、高剂量组和联苯双酯组TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表3 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响(±s，n＝10)Table 3 Effects of herba patriniae on TNF-α，IL-6 and IL-1βlevels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

组别Groups剂量(g/kg)Dose肿瘤坏死因子α(pg/mL)TNF-α白介素6(pg/mL)IL-6白介素1β(pg/mL)IL-1β对照组Control gourp 0 141.36±5.37 49.72±12.51 24.32±4.33模型组Model group 0 357.93±6.57* 193.37±19.44* 159.16±4.52*败酱草低剂量组Low dose herba patriniae group 4 196.86±5.53＃ 145.44±13.85＃ 140.97±5.63＃败酱草中剂量组Medium dose herba patriniae group 8 161.85±6.41＃ 127.61±15.01＃ 94.85±5.17＃败酱草高剂量组High dose herba patriniae group 16 121.74±6.36＃ 104.95±15.93＃ 52.60±4.47＃联苯双酯组Bifendatatum group 0.3 149.19±6.74＃ 120.9±10.45＃ 40.27±3.25＃

2.5 败酱草升高对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量

与对照组相比较，模型组SOD、GSH-Px含量显著降低(P<0.05)、MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比较，败酱草低、中、高剂量组和联苯双酯组SOD、GSH-Px含量显著升高(P<0.05)、MDA含量显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影响(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

表4 败酱草对对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤大鼠SOD、MDA、GSH-Px含量的影响(±s，n＝10)Table 4 Effects of herba patriniae on SOD，MDA and GSH-Px levels in rats with paracetamol-induced drug-induced liver injury

注:与对照组相比，*P<0.05；与模型组相比，＃P<0.05。Note.Compared with control group，*P<0.05.Compared with model group，＃P<0.05.

组别Groups剂量(g/kg)Dose总超氧化物歧化酶(U/mg Pro)SOD丙二醛(nmol/mg Pro)MDA谷胱甘肽过氧化物酶(U/mg Pro)GSH-Px对照组Control gourp 0 237.13±30.39 9.37±0.59 15.72±0.43模型组Model group 0 90.31±10.58* 11.25±0.42* 5.6±0.45*败酱草低剂量组Low dose herba patriniae group 4 167.64±24.54＃ 10.82±0.89＃ 7.8±0.56＃败酱草中剂量组Medium dose herba patriniae group 8 189.92±16.41＃ 10.17±0.62＃ 9.3±0.81＃败酱草高剂量组High dose herba patriniae group 16 217.54±26.39＃ 9.54±0.93＃ 11.24±0.44＃联苯双酯组Bifendatatum group 0.3 226.71±16.73＃ 9.22±0.46＃ 13.18±0.32＃

3 讨论

药物性肝损伤又称药物性肝病，由于化学药品数目增多及生物制剂和保健品的滥用，药物性肝损伤的发病率呈上升趋势[11]。建立APAP诱导的药物性肝损伤模型是研究药物保肝护肝活性的经典方法，以期进一步研究药物性肝损伤的机制，为开发安全高效药的新奠定基础。本文研究发现，败酱草具有改善APAP诱导的药物性肝损伤大鼠病理损伤程度，降低肝脏指数的作用。

天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)是常见的反应肝损伤的生化标志物，当肝细胞受损时，细胞膜通透性改变，AST、ALT、ALP释放进入血液，导致血清中AST、ALT、ALP水平升高[12－13]。本文研究发现，败酱草具有降低APAP诱导的药物性肝损伤大鼠AST、ALT、ALP水平的作用，提示败酱草对APAP诱导的药物性肝损伤大鼠具有降酶保肝作用。

肝损伤严重程度取决于炎症因子的释放程度，由于炎症反应参与APAP诱导的药物性肝损伤的发生发展过程，抑制炎症因子的释放有助于治疗APAP诱导的药物性肝损伤[14]。IL-6属于参与机体免疫应答的炎症因子，其含量升高可引发内脏功能性损害，同时使T淋巴细胞增殖、分化，从而加剧机体炎症反应[15]。TNF-α是肝中重要的促炎、免疫调节因子，可引发肝组织炎细胞聚集，IL-1β在多种脏器中起重要作用，其高表达预示着炎症的发生[16]。韩亮等[17]研究发现败酱草通过下调TNFα、IL-1β水平减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠的组织学损伤程度。Seo等[18]研究发现黄花败酱提取物能抑制急性胰腺炎大鼠炎症细胞因子的表达。本文研究发现，败酱草具有降低APAP诱导的药物性肝损伤大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用。提示败酱草抑制APAP诱导的药物性肝损伤大鼠炎症因子的释放。

APAP诱导药物性肝损伤的过程中，大量的氧自由基量生成和氧化应激次数的增多会加重肝损伤过程[19]。MDA是脂质发生过氧化反应的氧化终产物，测定MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度，SOD在人体中水平高低可间接反映机体清除自由基的能力。测定MDA及SOD含量，可有助于分析肝损伤程度和肝修复能力。GSH-Px可衡量机体抗氧化能力强弱，测定肝组织中GSH-Px含量能较好的反映机体抗氧化的能力，间接反映肝细胞膜的修复程度[20]。孟良玉等[21]研究发现败酱草提取物可显著降低小鼠血清及组织MDA含量，提高SOD、GSH-Px和CAT活力。本文研究发现，败酱草具有升高APAP诱导的药物性肝损伤大鼠SOD、GSH-Px含量，降低MDA含量。提示败酱草通过抗氧化应激对APAP诱导的药物性肝损伤大鼠具有保护作用。

综上所述，败酱草通过改善肝组织病理损伤，降低血清生化酶水平，抑制炎症因子的释放，减轻氧化应激水平对APAP诱导的药物性肝损伤模型大鼠具有保护作用。为临床应用败酱草治疗药物性肝损伤提供了一定实验依据，但败酱草对APAP诱导的药物性肝损伤的具体分子作用机制还需进一步实验探讨。