外周血Treg 细胞、Th17细胞在成人原发性免疫性血小板减少症中的变化及意义

汪嘉佳，李哲，江继发，程玮，金凤祥

铜陵市人民医院血液内科，安徽铜陵 244000

原发性免疫血小板减少症（ITP）是临床中常见的获得性自身免疫系统综合征，患者主要表现为皮肤黏膜出血症状，部分可表现为消化道的出血和损伤，严重者可发生颅内出血，对患者的身心健康造成严重的危害［1-2］。目前认为ITP的发病机制是机体抗血小板抗体产生后，血小板在单核吞噬细胞系统破坏中形成介导作用，从而导致患者体液免疫出现异常，最终导致血小板逐渐减少［3-4］。Treg 细胞与Th17细胞同属于T 细胞亚群，具有低反应性与免疫抑制性的特殊免疫调节功能，对自身反应性T 细胞的免疫反应和T 细胞的活化可产生抑制作用，同时还可促进某些抑制性细胞因子的分泌，在外周免疫耐受的维持中发挥重要作用［5-7］。研究发现，Treg/Th17失衡与多种免疫性疾病的发生、发展密切相关［8-9］。为此，本研究以成人原发性ITP 患者为研究对象，探讨外周血Treg 细胞、Th17 细胞百分比及Treg/Th17变化的临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2021年1月我院收治的80例成人原发性ITP 患者为研究对象（病例组），其中男37例，女43例；年龄18～65（44. 27 ±11. 35）岁。入组标准：符合中华医学会血液学分会血栓与止血学组制定的《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》［10］中成人原发性ITP 诊断标准；年龄18～65 岁，性别不限；首次发病，入组前未接受相关治疗；临床资料完整。排除标准：合并其他免疫疾病；合并恶性肿瘤；重要脏器功能不全；合并糖尿病、结核病、急性细菌性或病毒性感染；存在糖皮质激素治疗方案禁忌证；哺乳期、妊娠期妇女。另选取同期入院体检的80例健康者作为对照组，其中男35例，女45例；年龄18～63（45. 08 ± 12. 39）岁，血小板计数（120～280）×109/L，排除标准同病例组。两组性别、年龄比较差异均无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，患者自愿参加试验并签署知情同意书。

1.2 治疗及疗效评估 病例组接受一线的糖皮质激素治疗方案，口服醋酸泼尼松片（国药准字H33021217，浙江仙琚制药股份有有限公司）治疗，服用剂量1 mg/（kg·d），连续服用4周后评估治疗效果。按照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》［8］标准：完全反应，患者经过4周治疗，血小板计数≥100×109/L，且出血症状完全消失；有效，患者经过4周治疗，血小板计数≥30×109/L，且与治疗前相比增加2倍及以上，出血症状消失；无效，患者经过4 周治疗，血小板计数<30×109/L，或与治疗前相比增加不足2倍，或仍存在出血情况。血小板计数采用五分类全自动血细胞分析仪（型号URIT-5200，厦门海菲生物技术股份有限公司）测定。

1.3 外周血Treg、Th17 细胞检测 于清晨空腹状态下，分别取对照组外周血、病例组治疗前及治疗4周后外周血2 mL。Treg 细胞检测方法：取1mL 外周血置于流式试管内，加入肝素钠抗凝处理，避光条件下孵育20 min；加入溶血素1 mL 溶血，避光静置5 min，采用2 mL PBS 洗涤细胞2次，置于流式细胞仪（型号ZE5，美国伯乐）上测定Treg 细胞百分比。Th17 细胞检测方法：取上述培养后的细胞悬液600 μL，采用离心机于2 000 r/min转速下离心2 min（离心半径为10 cm），弃上清，向沉淀细胞内加入10 μL CD4-FITC 单抗（美国Abcam），避光条件下常温孵育15 min；采用PBS洗涤进行洗涤，加入100 μL固定液，避光条件下常温孵育15 min后，采用PBS二次洗涤、离心，弃上清，向沉淀细胞内加入100 μL 破膜剂，轻柔混匀后避光条件下孵育5 min，加入10 μL Alexa Fluor647IL-17 抗体（美国Abcam），充分混匀后于避光条件下孵育15 min；采用PBS 第三次洗涤细胞，离心，弃上清，将沉淀细胞置于流式细胞仪（型号ZE5，美国伯乐）上测定Th17 细胞百分比，计算Treg/Th17。

1.4 统计学方法 采用SPSS23. 0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，同组治疗前后比较采用配对样本t检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析外周血Treg、Th17 细胞百分比及Treg/Th17 对成人ITP 的诊断效能。P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组与对照组外周血Treg、Th17 细胞百分比及Treg/Th17 比较 与对照组相比，病例组外周血Treg 细胞百分比降低，Th17 细胞百分比升高，Treg/Th17降低（P均<0. 05），见表1。

表1 病例组与对照组外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

表1 病例组与对照组外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

组别病例组对照组t P n 80 80 Treg（%）4. 39 ± 0. 34 6. 14 ± 1. 30 11. 649<0. 05 Th17（%）2. 01 ± 0. 15 1. 34 ± 0. 36 15. 366<0. 05 Treg/Th17 2. 20 ± 0. 25 4. 96 ± 1. 88 13. 016<0. 05

2.2 病例组患者治疗前后外周血Treg、Th17 细胞百分比及Treg/Th17 比较 与治疗前相比，病例组治疗后外周血Treg 细胞百分比高，Th17 细胞百分比低，Treg/Th17高（P均<0. 05），见表2。

表2 病例组治疗前后外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

表2 病例组治疗前后外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

观察时间治疗前治疗后t P n 80 80 Treg（%）4. 39 ± 0. 34 5. 48 ± 0. 54 15. 278<0. 05 Th17（%）2. 01 ± 0. 15 1. 62 ± 0. 14 17. 001<0. 05 Treg/Th17 2. 20 ± 0. 25 3. 40 ± 0. 48 19. 832<0. 05

2.3 病例组治疗后不同疗效患者外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较 见表3。

表3 病例组治疗后不同疗效患者外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

表3 病例组治疗后不同疗效患者外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17比较（± s）

注：与有效相比，*P<0. 05；与无效相比，#P<0. 05。

疗效完全反应有效无效FP n 35 34 11 Treg（%）5. 76 ± 0. 45*#5. 35 ± 0. 50#4. 95 ± 0. 30 20. 332<0. 05 Th17（%）1. 54 ± 0. 12*#1. 68 ± 0. 12 1. 75 ± 0. 10 22. 583<0. 05 Treg/Th17 3. 77 ± 0. 41*#3. 20 ± 0. 28#2. 84 ± 0. 25 47. 129<0. 05

2.4 外周血Treg、Th17 细胞百分比及Treg/Th17 对ITP 的诊断效能 当外周血Treg 细胞百分比取4. 740% 时，诊断ITP 的ROC 曲线下面积（AUC）为0. 804，灵敏度为76. 3%，特异度为77. 5%；当Th17细胞百分比取1. 775%时，诊断ITP的AUC为0. 872，灵敏度为87. 5%，特异度为78. 7%；当Treg/Th17 取2. 585 时，诊 断ITP 的AUC为0. 901，灵 敏 度 为91. 3%，特异度为80. 0%；三者对ITP 均具有较高的诊断效能，其中Treg/Th17更优，见表4。

表4 外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17对ITP的诊断效能

3 讨论

ITP 可发生于各年龄段群体，其中男女发病率无明显差异，但育龄期女性略高于同年龄组男性，不同个体该病的临床表现存在较大差异［11］。已有研究指出，T淋巴细胞亚群在ITP免疫应答的诱导中起着关键作用，产生诱导后引起的T淋巴细胞活化可导致正常免疫细胞发生损伤［12］。Treg细胞来源于胸腺的天然性细胞，对病原Th1 和Th17 的细胞增殖有着显著的抑制作用，可通过对外周免疫耐受的维持来避免其自身免疫及组织的损伤［13］。Th17细胞作为新的CD4+T 细胞亚型，其分泌的IL-17 可作为前炎性细胞因子作用于中性粒细胞，促使多种细胞释放炎性因子，在自身免疫性疾病以及集体防御反应中具有关键作用［14］。研究表明，Treg 细胞在分化及功能上与Th17细胞相互拮抗，Th17/Treg细胞平衡对维持正常免疫应答及防止自身免疫病具有重要意义［15］。

在本研究中，相较于对照组，病例组外周血Treg细胞百分比降低、Th17 细胞百分比升高、Treg/Th17降低，提示由于成人原发性ITP 患者存在Treg/Th17失衡现象，可用于成人原发性ITP 的辅助诊断。分析其作用机制可能如下：Treg 细胞能够控制机体自身免疫反应，并且可抑制抗原特异性T 细胞的免疫反应，当Treg 细胞百分比下降后，机体免疫抑制功能受到抑制，导致T 细胞的异常激活、耐受水平降低；而Th17 细胞百分比上升后，其分泌的促炎因子IL-17 水平随之上升，炎症效应因子水平增加，促炎作用增加，并可能通过与其他细胞因子相互作用，导致细胞浸润及组织损伤，参与自身免疫过程，二者比值失衡后，机体免疫防御功能及稳定维护作用受损，可能通过破坏单核吞噬细胞系统引起血小板减少，最终参与成人原发性ITP 的发病过程［16-17］。徐丹等［18］以86例妊娠期ITP 患者为研究对象，通过流式细胞术检测发现其存在Th17/Treg 失衡状态；HUA等［19］发现，原发性ITP 患者存在Th17/Treg 失衡，并推测其可能与CD4+细胞内microRNA 的异常表达相关。疗效方面，与治疗前相比，患者治疗后外周血Treg 细胞百分比升高、Th17 细胞百分比降低、Treg/Th17 升高，随着疗效的增加此种改善趋势更佳明显，且完全反应、有效、无效间外周血Treg、Th17、Treg/Th17 存在差异，提示此方案可能通过改善Treg/Th17失衡状态，发挥治疗效果。分析其作用机制如下：ITP 发病与免疫功能受损、炎症反应相关，而醋酸泼尼松作为糖皮质激素类药物，一方面可有效抑制细胞介导的免疫反应，降低T 淋巴细胞水平并抑制其向淋巴母细胞转化，改善免疫失衡状态；另一方面，醋酸泼尼松可抑制包括Th17 分泌的IL-17在内的炎性因子水平、减轻炎症反应，最终发挥对ITP 的治疗作用，而疗效越好的患者此种改善越明显［20-21］。王颖超等［22］以ITP患儿为研究对象，得出了与本研究一致的结论，并推测Treg/Th17 测定可用于ITP患者疗效的预测。

本研究中外周血Treg、Th17细胞百分比及Treg/Th17 对ITP 均具有较高的诊断效能，三者的特异度基本相同，Treg/Th17的敏感度最高，诊断效能更优，这说明联合检测Treg/Th17 对提高实验室诊断ITP具有一定的帮助，在鉴别诊断中具有一定价值。

综上所述，成人原发性ITP 患者外周血Treg 细胞百分比降低、Th17 细胞百分比升高、Treg/Th17 降低，且其水平变化与患者治疗效果有关，可用于疾病的辅助诊断及疗效辅助评估。