沙地云杉菌根真菌的鉴定及其促生作用

张胜男，杨制国，袁立敏，胡小龙

(1. 内蒙古自治区林业科学研究院，内蒙古 呼和浩特 010010； 2. 内蒙古自治区沙地(沙漠)生态系统与生态工程重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010)

菌根是菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的联合共生体。据统计，全世界约97% 的陆生维管植物都能形成菌根结构。有研究表明，菌根真菌能够增强植物对水分和养分的吸收、促进光合作用、提高植物的抗旱能力[1-3]、改善和增加植株的生物量[4]。Smits等[5]研究认为，樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)幼苗接种外生菌根真菌，能够显著提高根际土壤有效磷的含量并促进植株生长。Zhang等[6]研究表明，油松(Pinustabuliformis)幼苗接种外生菌根真菌Handkeautriformis、Suilluslactifluus和Suillustomentosus能够显著提高幼苗根干重及根系活力。温祝桂等[7]研究表明，将外生菌根真菌接种至黑松(Pinusthunbergii)根部，显著提高了针叶叶绿素a、叶绿素b的含量，增加了黑松体内脯氨酸含量，同时显著降低幼苗根Na+/K+比值，从而促进了幼苗的生长。因此，菌根真菌在植物生长和土壤肥力改善中具有非常重要的作用。

沙地云杉(Piceamongolica)是内蒙古浑善达克沙地特有乡土树种之一，天然林集中分布在克什克腾旗的白音敖包自然保护区。森林火灾、病虫害使沙地云杉林的面积不断缩减，种群恢复工作刻不容缓。目前，关于沙地云杉菌根的相关研究大多集中于系统分类方面[8-9]，而对菌根促进生长等方面研究较少。基于以上原因，开展了分离鉴定沙地云杉菌根真菌的工作，并分析其促生作用，该研究对沙地云杉育苗以及种群恢复具有重要意义。

1 研究区概况

研究区位于内蒙古自治区克什克腾旗的白音敖包自然保护区内，地理坐标为43°31′03′′—43°31′29′′N，117°11′02′′—117°11′28′′E，平均海拔 1 338.43 m，属温带草原气候，年平均气温 -1.4 ℃，无霜期131 d，年降水量360～440 mm，集中于6—8月，年平均蒸发量1 036 mm。土壤为沙质灰色森林土。沙地云杉天然林长势良好，林下主要野生植物有蒙古黄芪(Astragalusmongholicus)、防风(Saposhnikoviadivaricata)、山刺玫(Rosadavurica)、扁蓿豆(Medicagoruthenica)和披碱草(Elymusdahuricus)等。

2 材料与方法

2.1 试验材料

沙地云杉根段样品于2017年7月采集。选择5～10 a生的沙地云杉幼苗20株，选择一侧挖出沙地云杉根部，取直径1～5 mm的根段若干，放入无菌自封袋中，置于4 ℃车载冰箱保存，尽快带回实验室进行菌种分离。沙地云杉种子采自白音敖包自然保护区沙地云杉天然林。盆栽育苗土壤为沙地云杉天然林土壤和蛭石以体积比1∶1混合。

2.2 试验方法

2.2.1菌根真菌分离

将采集的沙地云杉根段进行镜检，对具有菌丝团的根段在流动自来水下冲洗干净。将根段转移至无菌操作台中，用 75% 乙醇浸泡5 min，无菌水冲洗数次，再用 2% 次氯酸钠溶液浸泡12 min，充分消毒后用无菌水冲洗数次。消毒后的根段置于无菌操作台中自然风干，根段两端用灭菌的剪刀剪断弃除，根段中间部分置于PDA培养基上，两端紧贴培养基表面，每个培养皿中放置4段根段。吸取500 μL最后一次消毒的无菌水洗涤液涂布于PDA培养基上检测是否彻底消毒。在25 ℃恒温培养箱中培养7～10 d，待菌落长出后采用菌丝尖端切割分离法进行菌落纯化，直至获得纯菌。

2.2.2菌根真菌鉴定

采用分子生物学手段对沙地云杉菌根真菌进行鉴定。在培养过程中观察菌落的大小、质地、颜色、边缘等形态特征。同时，在培养皿上刮取足量的活化后菌丝，加液氮研磨成粉末后采用CTAB法提取真菌基因组DNA。以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增其ITS序列。PCR反应体系为20 μL：2.0 μL 10 × Ex Taq buffer，1.6 μL 2.5 mM dNTP Mix，0.8 μL ITS1，0.8 μL ITS4，0.5 μL模版DNA，0.2 μL 5u Ex Taq和 14.1 μL ddH2O。PCR反应参数为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。获得的PCR产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后送至上海生工公司测序，测序结果经过校对后通过GenBank的Blast进行在线同源性比对，明确沙地云杉菌根真菌的系统发育地位。

2.2.3促生作用分析

将分离获得的纯菌分别接种于硅酸盐和难溶性磷酸三钙固体PKO培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养约10 d，观察是否有菌落长出。

将收集的沙地云杉天然林土壤除去植物根，与蛭石按体积比1∶1混合均匀，分别装入纸杯中，121 ℃高温高压灭菌20 min，晾凉后在杯中放入6粒经次氯酸钠消毒的种子，浇入无菌水，待其发芽并持续培养4个月。

将筛选获得的纯菌在PDA培养基上重新活化，25 ℃培养7 d备用。将生长4个月的沙地云杉幼苗拔出，切断少量根部，刮取约2 g培养好的菌根真菌菌丝接种至根部并将幼苗移栽至育苗钵中，育苗钵土壤为沙地云杉天然林土壤与蛭石按体积比1∶1混合的灭菌土壤。每个育苗钵中移栽1株沙地云杉幼苗，接种菌根真菌的沙地云杉分别以菌种编号表示，分别为YSF1、YSF2、YSF3、YSF5、YSF6、YSF7、YSF8、YSF9；以不接种的沙地云杉幼苗为空白对照，并以YSCK标识。每个处理10次重复，共9种处理，合计90株。将沙地云杉幼苗置于光照充足的试验大棚中，培养温度约为25 ℃，光照12 h·d-1，定时观测并浇无菌水保持土壤湿润。

2.2.4测定项目及指标

菌根真菌接种沙地云杉幼苗6个月后，全部拔出，将根际及根围土壤风干待用。自来水清洗根部并用吸水纸吸干水分，从根基处测量沙地云杉株高；用剪刀从根基处剪断，将幼苗地上部分和根放入烘箱，80 ℃烘干24 h测定干物质量。土壤有机质测定采用重铬酸钾法，全氮和全磷测定采用高氯酸-硫酸消化法，全钾测定采用氢氟酸-高氯酸消化法，速效氮测定采用碱解扩散法，速效磷测定采用碳酸氢钠浸提-分光光度法，速效钾测定采用醋酸铵溶液浸提-原子吸收法。

2.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016进行数据统计及分析，绘图由Origin 8.6软件完成。

3 结果与分析

3.1 菌根真菌的鉴定和种类组成

将沙地云杉的根段贴在培养基上进行菌根真菌的分离培养，共获得8株菌根真菌。依据菌落形态观察(图1)。其中，YSF1为淡红色菌落，菌落边缘不规则；YSF2、YSF3和YSF9菌落为白色-浅棕相间，且有同心轮纹，边缘整齐；YSF5菌落为浅棕-深棕相间，有同心轮纹，边缘整齐；YSF6菌落为褐色，不规则边缘；YSF7和YSF8菌落颜色不同，培养7 d均能平铺整板，生长迅速，菌落边缘不规则。

图1 沙地云杉菌根真菌的菌落形态Fig.1 The colony morphology of mycorrhizal fungi from Picea mongolica

将获得的菌根真菌ITS序列与GenBank中公布的亲缘关系相近的菌种进行Blast在线比对，此8株菌分别为FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、Mycetinissp. YSF3、MarasmiusscorodoniusYSF5、Podosporasp. YSF6、AmbomucorsenatoinflatusYSF7、AmbomucorsenatoinflatusYSF8和Mycetinissp. YSF9。其中，2株归于子囊菌门，4株归于担子菌门，2株归于毛霉菌门；在目水平上，1株归于肉座菌目，1株归于粪壳菌目，4株归于伞菌目，2株归于毛霉目，伞菌目为优势目，占比50%。

3.2 促生作用分析

将分离获得的纯菌接种在PKO和硅酸盐选择性培养基上，观察是否有菌落长出，初步分析其溶磷和溶钾能力。结果表明(图2、图3)，菌株FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF3、Podosporasp. YSF6和AmbomucorsenatoinflatusYSF8能够在PKO固体平板上长出，透明圈直径与菌落直径之比在 1.04～1.33 之间，其中Mycetinissp. YSF3具有最大圈径比。Podosporasp. YSF6还能够在硅酸盐培养基上生长，但并未产生透明圈。

图2 菌根真菌溶磷情况Fig.2 Phosphorus solubilization of mycorrhizal fungi

将8株菌根真菌接种至沙地云杉幼苗根部进行促生作用分析，结果表明(图4)，接种Mycetinissp. YSF2和Mycetinissp. YSF9的沙地云杉幼苗株高分别比空白对照提高 5.15% 和 3.61%，但未达到显著性差异，其他菌株在6个月生长期内对沙地云杉幼苗株高没有明显促进作用。由图4可见，MarasmiusscorodoniusYSF5处理的沙地云杉地上部分干重比空白对照提高 20.44%，其他菌株均无显著促进效果；而多数菌株能够明显促进根的生长，其中FusariumacuminatumYSF1、Mycetinissp. YSF2、MarasmiusscorodoniusYSF5、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9分别比空白对照提高 53.68%、60.00%、67.37%、41.05% 和 32.11%，且YSF5达到显著提高水平。由此说明，接种菌根真菌在6个月生长期内明显提高了沙地云杉幼苗根的干物质量。

将沙地云杉幼苗连根拔出，收集根际及根围土壤并测定养分含量。由表1可知，接种菌根真菌可明显提高土壤有机质、全氮和速效氮的含量。与空白对照相比，接种菌根真菌后土壤有机质含量提高 23.99%～101.34%，全氮含量提高 27.27%～212.12%，速效氮含量提高 15.07%～52.48%。但接种菌根真菌对土壤全磷、全钾、速效磷和速效钾含量无明显影响。

注：不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

表1 不同处理沙地云杉根围土壤养分含量Tab.1 Nutrient content of rhizosphere soil of Picea mongolica with different treatments

4 讨论

菌根与沙地云杉长期共生，目前对沙地云杉外生菌根的研究主要集中于调查分类方面。尹彬[9]对沙地云杉外生菌根的宏观形态和显微结构进行观察，并描述了Conococum、Cortinarius和Tomentella的外部形态特征。田慧敏[10]在白音敖包自然保护区调查中发现8种沙地云杉外生菌根真菌，分别为毒粘滑菇(Hebelomacrustiliniforme)、大孢滑锈伞(H.sacchriolens)、红褐丝盖伞(Inocybefriesii)、灰锁瑚菌(Clavulinacinerea)、花形地星(Geastrumfloriforme)、小地星(G.minimum)、矮小地星(G.namum)和尖顶地星(G.triplex)。木兰[11]进一步调查了白音敖包自然保护区沙地云杉外生菌根真菌，包括辣牛肝菌(Chalciporuspiperatus)、花形地星、橙黄疣柄牛肝菌(Leccinumaurantiacum)、褐疣柄牛肝菌(L.scabrum)、铜绿红菇(Russulaaeruginea)、平滑红菇(R.aquosa)、葡紫红菇(R.azurea)、美味红菇(R.delica)、异褶红菇(R.heterophylla)、全缘红菇(R.integra)、较小红菇(R.minutula)、毒粘滑菇和草黄口蘑(Tricholomalascivum)13种。前人报道的沙地云杉外生菌根主要集中于滑菇属(Hebeloma)、地星属(Geastrum)和红菇属(Russula)。本研究中，共获得皮伞属(Mycetinis)3株，Ambomucor属2株，镰刀菌属(Fusarium)、Podospora属和小皮伞属(Marasmius)各1株，皮伞属为优势菌，这可能与采集的沙地云杉树龄不同有关。有研究表明，植物在不同生长阶段对养分的需求逐渐改变，通常随着植物成年光合作用增强，对菌根真菌的依赖减弱，菌根真菌类群也随之发生变化[12]。

本研究中，接种菌根真菌对沙地云杉的株高没有显著促进作用。沙地云杉自然生长缓慢，试验时间短可能没有明显变化，后期将增加长期观测实验，进一步明确菌根真菌对沙地云杉株高的促进作用。此外，本研究中接种菌根真菌对土壤全磷、全钾、速效磷和速效钾含量无明显促进作用，仅对土壤有机质、全氮和速效氮含量明显提升。Rillig[13]研究表明，外生菌根真菌不仅能够从寄主植物根系获取大量碳源，同时也能够释放更多的碳源到土壤中，菌根真菌更高的分泌速率导致输入土壤中的碳通量更大。此外，还有研究表明，菌根有助于植物对土壤氮素的积累[14]。外生菌根真菌可通过产生氮降解酶来获得更丰富的有机氮源[15]。Jargeat等[16]研究表明，宿主植物根系全氮的 75% 均来自于与其共生的根外菌丝吸收的氮素。张哲超等[17]在小果白刺(Nitrariasibirica)根部接种丛枝菌根，与对照组相比，接种处理显著增加了土壤有机碳含量，还使得土壤全氮含量显著提高了 152.54%。因此，接种菌根真菌对于土壤有机质和氮素提升发挥了重要作用。土壤全磷、全钾、速效磷和速效钾含量提升不明显可能与取样以及试验短期效应有关，本研究中将沙地云杉根际和根围土壤混合后测定土壤养分，根围土壤对于根际效应响应不强烈，可能是导致土壤养分提升不明显的重要因素[18]，而试验周期较短也会对土壤养分的改善效果不明显。

5 结论

沙地云杉根段多数会定殖菌根真菌，其中皮伞属为优势菌属。接种菌根真菌明显提高了沙地云杉幼苗根的干物质量、土壤有机质、全氮和速效氮含量，分别提高 14.74%～67.37%、23.99%～101.34%、27.27%～212.12% 和 15.07%～52.48%。总体而言，MarasmiusscorodoniusYSF5具有更强的促生能力，Mycetinissp. YSF2、AmbomucorsenatoinflatusYSF7和Mycetinissp. YSF9次之。这些菌株可作为沙地云杉育苗和造林的菌种资源储备。