SD大鼠颅骨垂直引导骨再生模型的建立

张泽鹏 卢旭光

人工种植牙技术现已成为缺牙修复的首选治疗方案。种植手术的成功依赖于足够的牙槽骨能为种植体提供良好的初期稳定性，以确保种植体与牙槽骨能形成稳定的骨结合[1]。然而，拔牙后的骨改建、外伤、牙周炎、颌面部肿瘤等因素常会引起患者牙槽骨的吸收和缺损，导致牙槽骨宽度与高度的不足[2]。其中常用的骨增量技术如引导骨再生(guide bone regeneration，GBR)、骨劈开、游离块状骨移植术可有效恢复牙槽嵴宽度。但恢复牙槽骨高度是目前未能有效解决的问题[3～5]。一个合适的用于研究垂直骨增量植骨材料的动物模型对研究者评估新材料的生物相容性、成骨性非常必要。本研究成功构建了大鼠颅骨垂直引导骨再生模型，现介绍如下。

材料与方法

1.实验动物：选用清洁级雄性SD大鼠24只，2月龄，体质量320g。动物来源于山西医科大学实验动物中心，动物生产许可证编号：SCXK(晋)2019-0005。该实验由山西医科大学实验动物伦理学委员会批准(SYDL2020007)。

2.实验材料：主要器械及药物包括定制钛壳(直径10mm，高6mm的类圆柱体，顶部有圆孔，太原钢铁集团有限公司，图1A)，膨体型聚四氟乙烯(expanded-polytetrafluoroethylene，e-PTFE)膜[直径12mm圆形，内面与钛壳顶部肩台对应部位设计有医用双面胶(型号3M1522)](深圳四维拓达科技有限公司),脱蛋白牛骨基质(deproteinized bovine bone matrix，DBBM，正海生物公司)。主要器械包括牙科打磨机，慢速弯机头(深圳市益岳牙科器材有限公司)，9mm、10mm 环形取骨钻(英国百诺公司)。主要药品包括戊巴比妥纳(西安科昊生物有限公司)，阿替卡因肾上腺素注射液(produits dentaires pierre rolland)，青霉素(北京索莱宝有限公司)等。

3.模型建立的手术过程：将大鼠随机分为两组，即支架组和空白组(每组12只)。适应性喂养1周后进行实验。实验前对手术器械，钛壳等清洗后进行高温高压蒸汽灭菌处理。大鼠禁食6h后，称重，腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠。大鼠头部剃毛，消毒，使用无菌记号笔在术区设计U型瓣。阿替卡因进行皮下注射，局部镇痛。使用显微眼科剪沿着标记做U型瓣，翻开的皮瓣用无菌0.9%氯化钠溶液润湿的纱布包裹置于大鼠颈部。骨膜剥离器去除大鼠颅骨中央偏颈部的部分骨膜。在无菌0.9%氯化钠溶液的冲洗下，使用10mm环形取骨钻在大鼠颅骨做一环形骨裂隙，深度0.5mm。在无菌0.9%氯化钠溶液的冲洗下，使用裂钻在骨裂隙内部做数个皮质骨穿孔，深度控制在刚好可以诱导出血，但不伤及大鼠硬脑膜。将钛壳放置在环形骨裂隙中，通过中央小孔填充DBBM(支架组)。e-PTFE膜封闭中央小孔，缝合。缝合后大鼠局部涂抹红霉素软膏进行局部抗菌处理。术后连续3天大鼠腹腔注射青霉素(80000U/d)预防感染。手术过程详见图1。

图1 大鼠颅骨垂直引导骨再生模型的构建过程A.钛壳外形；B.剃毛，消毒,红线代表耳缘和眼眶缘内侧，与皮瓣位置距离1cm左右；C.翻瓣，去除骨膜，制备环形骨裂隙；D.环形骨裂隙位置,黑线为两耳前缘连线；E.皮质骨穿孔；F.放置钛壳，填充植骨材料；G.e-PTFE膜封闭小孔；H.缝合

4.术后观察：手术后严密观察大鼠伤口愈合情况。术后3、7、14天对大鼠颅骨钛壳部位轻轻触诊，并记录钛壳松动情况。持续对大鼠软组织进行观察，并记录情况。术后12周，腹腔注射过量戊巴比妥纳安乐死大鼠，取材。无菌0.9%氯化钠溶液冲洗后，标本放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48h。取出样本，PBS冲洗3次，样本放入75%乙醇溶液中4℃ 保存送检。

5.Micro-CT扫描：将样本置于SkyScan 1176(德国布鲁克公司)的扫描球管中，固定，扫描。扫描参数如下，电压65kV，电流385μA，曝光时间340ms，扫描分辨率12.59μm，步长0.800°。扫描数据进行三维重建，选取样本中央直径5mm、高度6mm的圆柱体为要分析的感兴趣区域(region of interest，ROI)。对空白组和支架组ROI内的骨体积分数(bone volume fraction，BVF)进行分析。这里的骨体积分数定义为新骨体积/感兴趣区总体积×100 (%)。

6.组织学和组织形态学分析：完成micro-CT扫描的样本，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，塑化液塑化，包埋，硬组织切片，厚度10μm。组织切片进行HE染色，染色后进行白光扫描，将图形数据导入个人电脑，使用CaseViewer软件观察骨组织情况及拍照，Image-ProPlus 6.0软件对样本垂直骨高度(vertical bone height，VBH)进行测量。

结 果

1.大体观察结果：术后大鼠1h内相继苏醒，并饮食正常(图2A)。术后对大鼠软组织情况进行观察并记录，空白组(1只)和支架组(2只)共3只大鼠在术后3～8天内局部软组织出现坏死，表现为结痂组织过多，皮肤紧缩严重，钛壳暴露脱落。钛壳脱落大鼠随即排除。其余大鼠软组织愈合情况良好，仅少量愈合性结痂组织(图2B)，术后两周左右软组织完全恢复并进行了明显的适应性改建(图2C)。术后3、7、14天对大鼠颅骨钛壳部位轻轻触诊，评估钛壳固位情况。除去软组织坏死导致的钛壳脱落，其余大鼠钛壳均固定在设计位置。12周后取材，可见e-PTFE膜未脱落(图3A)，周围皮肤未出现红肿等炎性反应，钛壳位于手术设计区域(图3A)。空白组骨组织与钛壳轻轻使用外力即可以分离，而支架组骨组织与钛壳难以分离(图3B)，需借助9mm环形取骨钻将样本与钛壳分离(图3C)。

图2 SD大鼠手术后软组织愈合情况A.术后1h;B.术后7天拆线;C.术后14天

图3 骨组织样本情况A.钛壳稳定在实验设计区域；B.骨组织包裹钛壳；C.骨组织样本与钛壳分离整体观

2.Micro-CT分析：支架组micro-CT矢状剖面图4可见，钛壳固定在手术设计部位，未发生移位，且钛壳内面与新骨组织结合紧密。支架组的BVF为41.05%±5.04%，显著大于空白组22.75%±5.77%(P=0.000)。

图4 Micro-CT扫面样本示意图A.空白组三维重建图；B.支架组矢状剖面图；C.ROI示意图，中央灰色部分为ROI

3.组织学观察：组织切片观察，空白组在此模型下有一定的成骨潜力。颅骨表面形成含有骨髓腔的松质骨(图5A)。空白组垂直骨增量最高处位于样本中央。新骨顶部覆盖有结缔组织，内有大量毛细血管(图5B)。支架组样本可见由骨组织，DBBM颗粒以及结缔组织构成(图5D)。新骨主要沉积在靠近基底骨附近，并与颅骨融合，难以与颅骨区分(图5 C)。中部可观察到结缔组织包围着DBBM颗粒，与DBBM颗粒接触的界面有大量单核细胞，新骨组织无炎性反应。

图5 HE染色图A.空白组代表性切片(×15)；B.A图片中黑色方框区域(×1500)；C. 支架组代表性切片(×10)；D.C图黑色方框区域(×1000)；NB.新骨;CT.结缔组织;DBBM.脱蛋白牛骨基质;黑色圆圈所示为毛细血管

4.组织形态学分析：支架组的VBH(2.27±0.31mm)略优于空白组(1.86±0.20mm，P=0.002,图6)。

图6 Micro-CT分析结果和组织形态学测量结果A.Micro-CT分析结果；B.组织形态学测量结果；空白组n=11；支架组n=10;*P<0.05

讨 论

GBR即在骨缺损区使用屏障膜隔离上皮组织和结缔组织，使成骨细胞在没有其他细胞干预的情况下迁徙到骨缺损区并产生新骨[6]。本实验基于GBR的原理构建大鼠颅骨垂直引导骨再生模型，通过使用具有隔绝周围软组织以及支撑颗粒材料的屏障外壳来模拟临床上使用的屏障膜，可以为骨移植材料提供良好的成骨环境。从胚胎起源的角度来讲，颅骨与颌骨具有相同的胚胎起源[7]。从愈合模式来讲，颅骨与颌骨都是膜内成骨[8]；从临床转化的角度来讲，扁平的颅骨与重度萎缩的颌骨相似，因此可以选择颅骨作为研究用于垂直骨增量植骨材料的实验位点[9]。本实验选用320g雄性SD大鼠作为实验对象出于以下考虑：①对新材料或者新技术的初步探索，大鼠具有其他动物不可比拟的经济优势；②320g SD大鼠的颅骨较为平坦，可以选取较大范围的植骨区域进行屏障壳的安放；③SD大鼠相比于其他品系，性格较为温顺，方便手术操作以及术后护理。

本实验设计的屏障壳装置为直径10mm、高6mm、顶部开孔的类圆柱形钛壳。通过将钛壳放置在制备的环形骨裂隙上来防止其平行移动，通过头部皮肤的张力进一步固定钛壳。对术后大鼠观察表明，在软组织良好愈合的情况下，钛壳不会发生移位。钛壳顶部小孔用带有医用双面胶的e-PTFE膜封闭。e-PTFE膜具有生物惰性，其表面小孔具有限制上皮细胞迁移的功能，临床上常使用金属加强型e-PTFE膜处理复杂的垂直骨增量手术[10,11]。对内部皮肤和骨组织切片的观察证实医用双面胶与钛壳肩台相接触，不会引起大鼠局部炎性反应。

本实验钛壳设计与Zigdon等[12]的外壳设计比较，简化了屏障装置的加工与制作，同时手术操作更为便捷，不需要额外的螺钉固位屏障装置，同时顶部开孔设计方便了植骨材料的填充。类圆柱体设计与半球形屏障装置比较，植骨材料能填充到均匀的高度，在后期容易比较成骨效果[13]。钛壳与机体组织具有良好的生物相容性，支架组Micro-CT矢状剖面图可观察到新骨沿着钛壳壁生长，保证了实验过程中钛壳的稳定性。Lai等[14]设计了一种带螺纹的自攻型钛筒，并成功构建兔颅骨垂直骨增量模型。但大鼠颅骨较薄，此钛筒设计不适用于大鼠颅骨模型的构建。本实验在大鼠颅骨仅放置一个钛壳，这是由于大鼠颅骨面积所限。对空白组样本的观察表明大鼠颅骨在此模型中有一定的自发垂直向成骨潜能，Zigdon等[12]开展的实验也证实了这一点(空白组新骨高度可达1.52±0.18mm)。有实验小组通过降低屏障装置高度与直径，每只大鼠接受两个屏障装置[15]。虽然能减少大鼠的使用数量，但过小尺寸的屏障装置可能会被大鼠自身的成骨潜能所影响，不能客观地比较不同生物材料的垂直成骨潜力。

综上所述，本实验成功构建了大鼠颅骨垂直引导骨再生模型，可操作性强，能客观比较不同植骨材料的垂直骨成骨潜力，为研究垂直骨增量植骨材料的实验奠定了基础。