清热化瘀方对缺血再灌注大鼠脑组织的保护效应及机制

秦红玲 胡跃强 农必华 陈 炜 程 越 卢健锋 谭璐璐

脑动脉栓塞引起的缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)占所有脑卒中疾病的60%～80%，可造成局部血液供应紊乱，导致高发生率和高病死率[1]。溶栓或手术以尽早恢复血流是治疗IS的主要策略，但该过程常导致脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)损伤[2]。清热化瘀方是治疗IS的中药复方，临床疗效确切，具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，可有效改善大鼠脑I/R损伤[3～5]，但其作用机制尚不明确。大量研究证实，microRNA(miRNA)参与调控脑I/R损伤机制，可能是该病治疗的新靶点[6]。笔者预实验发现，miR-503-5p在清热化瘀方治疗脑I/R大鼠前、后存在差异表达。查阅文献发现，miR-503-5p可通过靶向抗凋亡因子Bcl-2，进而诱导内皮细胞凋亡[7]。提示清热化瘀方可能通过调控miR-503-5p/Bcl-2通路，进而发挥抗凋亡作用。故本研究以脑I/R大鼠为研究对象，基于miR-503-5p/Bcl-2通路介导的细胞凋亡机制，进一步探究清热化瘀方对脑I/R大鼠脑组织损伤的保护效应及机制，为清热化瘀方的临床应用提供更多的依据。

材料与方法

1.材料：SD大鼠(合格证号：SCXK2016-0005)由广西医科大学实验动物中心提供。清热化瘀方(共9味中药：水牛角30g、丹参15g、赤芍15g、地龙10g、石菖蒲10g、川芎10g、郁金10g、酒大黄6g、天竺黄10g)由江阴天江药业有限公司制备(批号：0904099)。Trizol、RIPA裂解液、BCA试剂盒购自北京Solarbio公司。反转录试剂盒、real-time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。miScript反转录试剂盒购自德国Qiagen公司。抗体Bcl-2、Bax购自美国BioVision公司。抗体caspase-3、caspase-8、caspase-9、β-actin、山羊抗兔二抗HRP-IgG和TUNEL染色试剂盒购自英国Abcam公司。

2.动物分组及处理：SD大鼠，体质量300～400g，16～20周龄，分为正常组、假手术组、模型组、清热化瘀方组，每组10只。除正常组外，其余各组均采用线栓法进行处理。清热化瘀方组灌胃清热化瘀方剂[1.4毫升/(100克·次)]，每天2次，其浓度及等效剂量按体表面积折算。正常组、假手术组和模型组均灌胃等体积0.9% NaCl溶液。各组大鼠均正常饲养，自由饮水，4天后处死取缺血灶周围脑组织进项各项检测分析。动物实验均符合动物伦理要求。

3.动物模型建立：采用大鼠大脑中动脉梗阻(MCAO)模型，参照Longa线栓法进行[8]。模型建立具体步骤：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，平卧固定于手术台，颈部术区备皮、消毒，于旁正中切开长2～4cm切口，钝性分离肌肉，暴露术野，分离颈总、颈外和颈内动脉，近心端结扎颈总动脉并于动脉下备线，用动脉夹夹闭颈内动脉，用留置针刺破颈总动脉使血流入留置针内，撤掉留置针，将尼龙线栓插入刺破的颈总动脉孔，并用弯头眼科镊将线栓经颈内动脉进入颅内推送至大脑中动脉起始处(进线18～20mm可感觉到阻力)，阻断大脑中动脉血流，缺血2h后去除线栓再灌注，缝合切口。假手术组线栓只进入颈内动脉9mm，不栓塞大脑中动脉，去除线栓缝合切口。

4.TUNEL染色：取各组大鼠脑组织常规脱水固定，石蜡包埋，切片。按TUNEL染色试剂盒说明书操作。在400倍显微镜下，于缺血灶脑组织边缘随机选取视野，观察切片中TUNEL阳性细胞数(细胞核为棕色)，凋亡阳性率(%)=单位面积内凋亡细胞数/细胞总数×100%。

5.应用RT-qPCR法检测：采用Trizol法提取各组细胞总RNA，进行反转录及实时荧光定量PCR反应，按操作说明书进行。PCR程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。引物由华大基因合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

6.Western blot法检测：RIPA裂解液裂解组织提取总蛋白，BCA法定量后，取80μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2h，分别孵育相应蛋白一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜10min×4次，室温孵育HRP标记二抗2h，TBST振摇洗膜10min×4次。ECL试剂发光后用凝胶成像仪拍照，Image J软件计算条带灰度值。

结 果

1.清热化瘀方对缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡的影响(图1)：采用TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡情况，与正常组比较，模型组缺血灶脑组织凋亡细胞数明显增多，凋亡率显著升高(P<0.05)。与模型组比较，清热化瘀方组缺血灶脑组织凋亡细胞数明显减少，凋亡率显著降低(P<0.05)，假手术组与正常组的检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 TUNEL染色(×400)A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.清热化瘀方组。与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.清热化瘀方对大鼠脑组织Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8及caspase-9表达的影响：详见表2、表3、图2。采用RT-qPCR和Western blot法检测凋亡相关因子的表达，结果显示，与正常组比较，模型组缺血灶脑组织中Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表达水显著升高(P<0.05)。与模型组比较，清热化瘀方组缺血灶脑组织中Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著升高，Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表达水显著降低(P<0.05)。假手术组与正常组的检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 大鼠脑组织中凋亡标志蛋白的Western blot法检测结果

表2 各组大鼠脑组织凋亡标志物mRNA的相对表达

表3 各组大鼠脑组织凋亡标志蛋白的相对表达

3.清热化瘀方对缺血再灌注大鼠脑组织miR-503-5p表达的影响：RT-qPCR检测结果显示，与正常组比较，模型组缺血灶脑组织中miR-503-5p表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，清热化瘀方组缺血灶脑组织中miR-503-5p表达水平显著降低(P<0.05)。假手术组与正常组miR-503-5p表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图3。

图3 清热化瘀方对缺血再灌注大鼠脑组织miR-503-5p表达的影响与正常组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05

讨 论

脑I/R损伤的细胞和分子机制复杂，包括钙离子超载、活性氧暴发、炎症、血-脑脊液屏障破坏、凋亡基因的激活等，这些恶性循环最终导致细胞凋亡或坏死[9～12]。其中，细胞凋亡被认为是脑缺血损伤的关键事件[13,14]。caspase家族是调控细胞凋亡过程的关键执行者。经典细胞凋亡的激活主要通过两条途径进行。其中一种是外源性途径，其通过激活细胞表面的死亡受体(如Fas)而启动，导致caspase-8或caspase-10的激活。另一种途径是内源性途径，也称为线粒体凋亡途径，其起源于细胞色素C的线粒体释放和相应的caspase-9的活化。这两种途径均导致信号级联反应，集中于caspase-3的激活，最终导致细胞凋亡。此外，抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax是目前已知在凋亡过程中的关键标志物[15]。Bax通常与Bcl-2保持平衡，参与调控线粒体膜的通透性，控制细胞色素C的释放和caspase家族的活化[16]。本研究发现，大鼠脑I/R损伤后缺血灶凋亡细胞数明显增多，Bcl-2表达降低，Bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9表达升高，符合脑I/R损伤后神经元凋亡机制，提示上调抗凋亡基因的表达，并抑制促凋亡途径激活，是减轻脑I/R损伤的关键。

miRNA是一类高度保守、单股的非编码小RNA，约有20～30个核苷酸，主要通过与目标mRNA的3′ UTR结合，导致mRNA降解或翻译抑制[17]。并且，miRNA在IS的炎症、氧化应激和凋亡中均发挥着重要的调控作用[18]。提示miRNA有望成为脑缺血诊断和预后的潜在生物学标志物以及治疗靶标。研究发现，血清miR-503-5p在IS合并糖尿病患者急性期呈高水平，是预示脑卒中严重程度和短期预后的潜在标志物[19]。另外，在高糖刺激的人脐静脉内皮细胞和2型糖尿病大鼠的心肌微血管内皮细胞中，miR-503-5p的水平明显升高[20, 21]。miR-503-5p可通过靶向抑制Bcl-2的表达，进而诱导人肺微血管内皮细胞凋亡[7]。最新研究表明，miR-503-5p是IS的独立危险因素，IS患者血浆miR-503-5p在急性期、重症及LAA、TACI亚型中明显升高，miR-503-5p拮抗剂可部分抑制永久性MCAO小鼠脑血管内皮细胞凋亡和ROS生成，脑血管内皮细胞体外实验证实敲除miR-503-5p可上调Bcl-2的表达，进一步提示miR-503-5p/Bcl-2通路在脑I/R损伤中起关键作用[22]。本研究通过检测大鼠脑I/R损伤后缺血灶miR-503-5p的表达，发现缺血组织中miR-503-5p表达显著高于正常脑组织，同时伴随着Bcl-2的低表达，证实miR-503-5p参与了脑I/R损伤过程并起着促凋亡的作用，且作用机制与Bcl-2介导的细胞凋亡机制有关。

如何减少脑I/R损伤一直是医学界关注的问题。中医认为，IS属“中风”范畴，其病因病机多以“风、火、痰、瘀、虚、毒”为主[23]。根据王永炎院士提出的“毒损脑络”观点，研制清热化瘀方治疗IS，并取得了良好的临床效果。前期研究已证实，清热化瘀方具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，还可有效降低过度自噬，清除自由基，促进缺血半暗带区的血管新生，减轻脑I/R损伤，保护神经元。然而，清热化瘀方改善脑I/R损伤的作用机制尚未完全阐明。研究表明，缺血核心内的血流减少伴随着不可逆的神经细胞坏死，而缺血半暗带内出现的细胞凋亡在缺血后数小时内可逆，因此抑制细胞凋亡是治疗脑卒中的重要策略[15]。本研究在前期研究基础上，进一步探究清热化瘀方的抗凋亡机制。结果发现，脑I/R大鼠经清热化瘀方治疗后，脑缺血组织中Bcl-2表达显著升高，miR-503-5p、Bax、caspase-3、caspase-9表达及脑组织凋亡率均显著降低，表明清热化瘀方的抗凋亡机制与miR-503-5p/Bcl-2通路有关，其可能通过下调神经元miR-503-5p的表达，促进Bcl-2表达，从而抑制细胞色素C的释放和caspase家族的激活，进而改善脑I/R损伤，保护神经元。

综上所述，细胞凋亡是加速脑I/R损伤的关键因素。本研究结果表明，清热化瘀方可抑制脑I/R大鼠脑组织细胞凋亡，且机制可能与抑制miR-503-5p、Bax及caspase家族表达、上调Bcl-2表达有关，进一步证实清热化瘀方可有效减轻脑I/R损伤，发挥神经元保护效应，具有一定的临床应用价值。