抗菌肽的研究进展

姜雯雯

近些年来，抗生素的广泛使用导致细菌耐药性增强以及药物残留的问题日益凸显，而抗菌肽具有广谱抗菌、无免疫原性、杀菌速度快等特点，可以作为一种新型抗菌药物而具有广泛的应用前景[1]。抗菌肽，又称宿主防御肽，被认为是先天免疫的重要组成部分，广泛存在于真菌、细菌、动物和植物中，不仅可以直接影响微生物，还可以提高淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞水平进而增强机体的免疫反应。自20世纪80年代Hultmark在惜古比天蚕中分离并命名为天蚕素以来，至今为止在细菌、真菌、动物、植物中已发现了2000多种具备抗菌活性的抗菌肽。

1 抗菌肽的分类

1.1 植物抗菌肽

最早在植物中发现的抗菌肽是硫素（thionin），之后又从植物的花、叶、果中发现了其它类别的抗菌肽如：植物防御素（plant defensins）、橡胶蛋白、打结素类（knottin-like peptides）、酯转移蛋白酶（lipid trans⁃fer proteins）、蜕皮素（snakins）和环肽类（Cyclotides）等[2]。其中，硫素、酯转移蛋白酶、植物防御素在植物抗病工程中得以应用，部分植物抗菌肽和特性见表1。在应用方面，国内开发了一些可以表达不同含量植物抗菌肽的转基因植物，对植物疾病有着不同抗性，可以用作保护植物的一种方式，但植物抗菌肽生产成本高等技术问题尚未能解决，所以无法用于商业化量产。植物抗菌肽在畜牧领域可以作为饲料改善牲畜胃肠道功能，在食品领域可以作为天然防腐剂。

表1 植物抗菌肽的特点及分布

1.2 昆虫抗菌肽

昆虫类抗菌肽提取自昆虫，现今已有200多种抗菌肽在昆虫体内被发现常见的如蜜蜂、甲虫、天蚕、果蝇等。它的产生是由于昆虫受到感染或刺激时由昆虫血淋巴产生的一种多肽物质，具有抗菌广、不破坏正常细胞等优点，此类抗菌肽在完全变态和不完全变态昆虫体内的产生方式不同，在前者体内是由上皮细胞和脂肪体迅速合成然后释放到血淋巴中，在后者体内是先在健康昆虫体内血细胞中合成，受到感染或刺激后才释放到血淋巴中。根据这些多肽的抗菌功能和氨基酸排列顺序主要分为五类：富含甘氨酸的抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽、昆虫防御素、天蚕素类抗菌肽（见表2）。

表2 部分昆虫抗菌肽来源和结构特点

昆虫抗菌肽在医药、农业、食品贮藏等方面都有研究，目前昆虫抗菌肽中的尼生素是唯一一个被批准运用于食品防腐的抗菌肽[3]。昆虫的免疫机制在某些方面与人类免疫机制相似，进一步了解昆虫的免疫机制为炎症性、感染性疾病的预防和治疗提供参考[4]。

1.3 哺乳动物抗菌肽

哺乳动物抗菌肽主要存在于哺乳动物的白细胞、皮肤和黏膜的上皮细胞中。此类抗菌肽研究最多的是防御素类抗菌肽，哺乳动物防御素(defensins)有α- defensins 和β- defensins 两种类型。Defensins能够迅速的作用于病毒和细菌的细胞膜，通过穿膜机制起到抗菌、抗病毒的作用，而且还能参与机体的免疫调节，例如富集炎性细胞和促进炎性因子产生等作用。自发现以来，已从猪、兔、牛、马均提取出了高活性的抗菌肽，如1980年Leherer从兔肺的巨噬细胞中发现了一种富含半胱氨酸Cys 残基的防御素；1989年Lee 从猪小肠中分离提取出抗菌肽cecropin P1；1991年Diamond G从牛的气管黏膜上皮细胞中发现了TAP。目前，在人体内只发现了一种名为LL-37的cathelicidin内源性抗菌多肽，分子量为18ku，含37个氨基酸，不仅能够参与免疫反应，还能帮助血管生成和促进伤口愈合[5]。

表3 鱼类和两栖动物类抗菌肽功能比较

1.4 鱼类和两栖动物类抗菌肽

目前已报道的鱼类抗菌肽大多存在于表皮黏液中，还有部分存在于其他组织器官中，如铁调素（hep⁃cidins）、内源性抗菌肽（cathelicidins）、肝表达抗菌肽2 抗体（LAEP-2）等，研究表明鱼类抗菌肽具有一些独特属性，如在较高盐浓度下仍具有生物活性。鱼类抗菌肽目前已从各种鱼类动物（虹鳟、河鳟、大鳞大马哈鱼等）中提取出来。两栖动物种类繁多，在中国大陆的两栖动物约2/3的两栖动物是中国特有种，且同一物种皮肤分泌物的种类也有所不同，如抗菌肽、抗癌肽、速激肽、缓激肽促胰岛素释放肽等等一系列生物活性肽。最具有代表性的两栖动物要属蛙类，蛙类的皮肤为它们的生长发育提供了先天条件。由于蛙类皮肤湿润而且暴露于空气中，正好适宜病原体生长繁殖，为抵抗这些病原体的侵害，表皮腺体会分泌一系列抗菌肽。蛙类抗菌肽在抗肿瘤、抗病毒活性方面均有研究，例如从中国大蹼铃蟾皮肤提取的Maximin 3 抗菌肽能够抑制HIV 感染T 细胞，从欧洲林蛙皮肤分泌物提取出的Temporin L 能诱导肿瘤细胞死亡。

1.5 细菌抗菌肽

细菌抗菌肽根据其合成途径可分为两种：一种是核糖体合成抗菌肽；另一种是非核糖体合成抗菌肽，即通过非核糖体多肽合成酶基因控制来合成，统称为抗菌脂肽[6]。目前在细菌中发现的抗菌肽有：乳酸球菌素（Nisin）、多粘菌素E（PolymyxinE）、杆菌肽（Bacitracin）、短杆菌肽S（GramicidinS）等，其中，乳酸球菌素（Nisin）研究最多，由乳酸菌产生，仅限于对革兰氏阳性菌起作用，而对革兰氏阴性菌无效。还有乳酸菌产生的乳链球菌素lacticin 3147，被用于食品保藏。细菌抗菌肽与来自动物的抗菌肽有所不同，细菌抗菌肽具有一定的毒性，而且效力比较高，在纳摩尔浓度可抑制细菌甚至杀死细菌，这也是它们能占据生态位的一个重要原因。

2 抗菌肽的应用

如今，抗菌药物的种类越来越多，细菌的耐药性也随之加强，抗菌肽的发现使得这个局面变得好转。抗菌肽不仅能抗菌，而且还能抗病毒、抗肿瘤。目前已知的抗菌肽多达2500 余种，部分抗菌肽在临床研究表现出功效良好且具有低副作用的特点，如抗菌肽MU1140和菌丝霉素等，还有部分抗菌肽已经进入临床试验[7]。此外，抗菌肽还可以运用在食品保鲜方面和畜牧养殖方面。

2.1 食品保鲜中的应用

食品加工中难免会加入化学防腐剂以确保食品新鲜，但化学防腐剂不易被人体吸收且加热后容易变性，对人体有一定危害。抗菌肽进入人体后可以被蛋白酶水解，而且食品加热也不容易使抗菌肽变性[8]。有实践证明在动物日粮中添加抗菌肽后，不仅可以改善其肠道功能，而且还能提高动物抵抗力，对动物的生长性能也有利，国内外许多企业已经研发成功[9]。有研究表明，鲜牛乳中加入乳酸菌素后不仅可以延长货架期还可以保留原有风味，再结合巴氏灭菌，保留时间将更长。将某些抗菌肽如：细菌素、尼生素、植物防御素等添加到食品包装上可以达到保鲜、防腐效果。

2.2 畜牧养殖中的应用

在畜牧养殖中，传统方法是在饲料中添加抗生素，容易破坏肠道微生物并且容易残留，严重影响人的身体健康和产品质量[10]。随着对抗菌肽了解更加深入，众多研究表明抗菌肽添加到饲料中可以增强动物免疫力，降低患病率，提高生产质量。李生涛[11]在喂养母猪的饲料中加入抗菌肽，降低了弱仔率而且还减少了母猪流产；覃志彪[12]等人在虾苗的基础饵料中加入抗菌肽，通过五组不同浓度的实验对比，发现虾的体长增长率、成活率、增重率有提高。

3 抗菌肽制备方法

国内外制备食源性肽的方法主要有酶解法、化学合成法、基因工程法及微生物发酵法等。多种方法的组合或者单独使用都广泛地应用于生物活性肽的分离制备中，不同方法适合不同目的，各有其优缺点。基因工程虽然成本低还能大量获取抗菌肽，但得到的抗菌肽抑菌活性会比天然抗菌肽低[13]；除化学合成和基因工程，其它方法均需要大量原材料，需要从生物中提取，利用微生物蛋白酶反应发酵是用来产生生物活性肽和食源性蛋白质的一种有效方法。某些特定的菌类群，能够化合生物体的蛋白质以及氮元素，提取出的酶化物以及维生素等物质可以直接抑制病原菌，降解难分解的物质，极易被植物体吸收，增强其防病害的功能。目前国内外研究较多的为乳蛋白与大豆蛋白，可从中分离出多种活性多肽[14]，张志焱[15]等对一株产抗菌肽枯草芽孢杆菌BL0006的发酵培养基和发酵条件进行优化，提高发酵液中抗菌肽的效价。

酶水解法是产生活性肽的主要方式，具有较低成本、反应极易控制、不易出现意外以及能够定位生产等诸多相关的优点，可以很好地满足产品需求。酶水解法最重要的则是蛋白酶的选用，需要定点酶切，还要符合食品安全。一些常见的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等既能单独使用，又可以组合产生更多稳定、高效的生物活性肽。如Pellegrini等[16]使用胰蛋白酶水解牛乳β-乳球蛋白，获得四种具有抑菌活性的肽段。顾晨涛[17]等用胃蛋白酶解等工艺得到具有较强抑菌活性的鲫鱼鱼鳞抗菌多肽，Zeineb等[18]利用驼乳蛋白酶水解产物进行了抑菌试验，结果表明骆驼初乳的抗菌活性高于牛乳，且经过与未处理原乳的对比实验得出蛋白酶解后释放出更多具有抗菌活性的肽。刘云姣[19]等人通过响应面法优化南极磷虾蛋白酶解工艺研究表明：胰蛋白酶为最适蛋白酶，最佳条件是在44.48℃温度下，PH为7.88，酶解时间8.52h，这项研究的结果带来了很好的启示——可以从南极磷虾中提取抗菌肽且资源丰富。

4 展望

无论是原核生物还是真核生物，体内多多少少存在具有防御作用的抗菌肽，它们抗病毒、细菌、真菌且不易引起微生物耐受的特点引起了广大科学家的注意，也因此有了很广阔的应用前景。抗菌肽虽然可以借助基因重组技术或化学合成的方法来降低成本，但对其生产出的抗菌肽作用稳定性、药效学、药动学以及毒副作用还未能清楚[20]。且应用于牲畜的食品添加剂以及美容业的抗菌肽生产成本高、对真核细胞的毒性作用、体内代谢过程、体内代谢对机体的影响等问题都亟待需相应方法来解决，就生产成本而言，目前大多是应用基因工程来提高生产率从而降低生产成本，还可在分离纯化环节入手来提高生产效率。总之，在科学的前进道路上，发现问题进而解决问题，将现存问题解决之后，方能造福人类。