复合酶协同超声辅助提取东北土当归叶中总黄酮及其抑菌活性的研究

吴淑清，艾丛苹，栾茗然，朱文秀

(1.长春大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130022；2.浙江李子园食品股份有限公司，浙江 金华 321000)

东北土当归，学名长白楤木，又称草本刺嫩芽、狗苦龙芽等[1]，营养物质极为丰富，既是山野菜，又是中草药。古医书记载其根可入药，具有祛风燥湿、解热镇痛、疏风活血和利尿解毒等功效[2]。东北土当归中黄酮类化合物和苷类化合物具有较强的抗氧化活性[3]，贝壳烯酸、贝壳杉醇酸、海松酸等二萜成分具有镇静作用[4]。此外，其叶中含有的某些成分具有降血压、降血糖、抗炎镇痛、预防心脑血管疾病、延缓衰老和保护神经系统等功效[5]。

复合酶协同超声波提取东北土当归叶中总黄酮的原理是，酶可破坏植物组织细胞，使细胞壁破裂，从而降低与溶剂之间的传质阻力[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北土当归：由长春大学园林学院王晓红教授的实验种植基地提供；芦丁标准品：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶(400 U/mg)、果胶酶(50000 U/g)：美国sigma公司；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠：天津市福晨化学试剂厂，均为分析纯；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司。

供试菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，均为长春大学实验室留存菌种。

1.2 仪器与设备

WJX-A1000型高速多功能粉碎机：上海缘沃工贸有限公司；超声波清洗器：深圳市洁盟清洗设备有限公司；721型可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司；TDL-50B低速离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 东北土当归叶预处理

将新鲜东北土当归叶清洗干净，自然晒干后，置于粉碎机中粉碎，再过40目(0.425 mm)筛，装入密封袋，冷藏保存备用。

1.3.2 总黄酮提取工艺流程

东北土当归叶总黄酮提取工艺流程见图1。

图1 东北土当归叶总黄酮提取工艺流程

1.3.3 标准曲线的制作

将芦丁标准品经110 ℃干燥至恒重，冷却至室温备用。称取芦丁标准品10 mg，用30%乙醇于50 mL容量瓶中定容，超声溶解5 min，可得浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液，冷藏保存备用。分别吸取芦丁标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的比色管中，各加入5%亚硝酸钠溶液1 mL、10%硝酸铝溶液1 mL、1 mol/L氢氧化钠10 mL，最后用50%乙醇定容至刻度线，摇匀，放置10 min，于510 nm处测定吸光度[7]，绘制标准曲线。得到回归方程：y=10.232x+0.0049(R2=0.9992)，式中，y为吸光度，x为芦丁质量浓度(mg/mL)。结果表明，芦丁标准品溶液浓度为0.01～0.05 mg/mL时，与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.4 东北土当归叶总黄酮的测定

吸取5 mL样液于25 mL容量瓶中，其他操作按照制作标准曲线的方法处理。计算东北土当归叶中总黄酮含量，公式如下：

式中，T：总黄酮物质的含量，mg/g；C：总黄酮质量浓度，mg/mL；V：总黄酮提取液体积，mL；m：样品质量，g；n：稀释倍数。

1.3.5 单因素实验和正交试验

采用复合酶协同超声波提取法从东北土当归叶中提取总黄酮，以总黄酮提取量作为衡量标准，确定各因素的最适范围。单因素实验因素水平见表1。

表1 单因素实验因素水平

在单因素实验的基础上，设计L9(34)正交试验，以确定总黄酮的最佳提取工艺。正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平

1.3.6 总黄酮提取液的抑菌试验

吸取0.1 mL无菌水，将菌液稀释为0.5个麦氏比浊度的菌悬液，再用移液枪吸取100 μL稀释菌液滴加在平板上，用涂布棒将菌液均匀涂布在灭菌平板上。用无水乙醇将总黄酮提取液分别稀释成不同浓度，将灭菌后的滤纸片浸泡在提取液中1 h，于紫外灯下照射20 min。用无菌镊子夹取滤纸片，3片一组等间距放在培养基上。用浸有无菌水的滤纸片做对照，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出后观察是否有透明圈[8]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 复合酶比例对总黄酮提取量的影响

由图2可知，当复合酶(纤维素酶/果胶酶)比例为1∶2时，总黄酮提取量达到最大值。纤维素酶占比的增加能更好地破坏东北土当归叶的细胞壁，使得细胞中的总黄酮物质更好地溶出；但纤维素酶占比过高时，底物浓度不能使复合酶达到饱和状态，复合酶的作用会受到抑制，进而导致总黄酮提取量降低[9]。

图2 复合酶比例对总黄酮提取量的影响

2.1.2 料液比对总黄酮提取量的影响

由图3可知，当料液比为1∶40(g/mL)时，总黄酮提取量达到最大值。但随着溶剂量的增加，一方面总黄酮类物质的溶出量有限；另一方面溶剂过多会导致其他杂质的大量溶出，而有些杂质与总黄酮类物质之间存在拮抗作用，会影响提取效果[10]。

图3 料液比对总黄酮提取量的影响

2.1.3 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

由图4可知，当乙醇浓度为40%时，总黄酮提取量达到最大值。根据相似相溶的原理，极性越接近，溶解度越大。当乙醇浓度为40%时，溶剂的极性和黄酮的极性最为接近，黄酮溶解度最大[11]。

图4 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

2.1.4 超声温度对总黄酮提取量的影响

由图5可知，当超声温度为50 ℃时，总黄酮提取量达到最大值。适当升高温度有利于总黄酮类物质的溶出；但过高的温度会导致总黄酮类物质氧化和降解，使提取量下降[12]。

图5 超声温度对总黄酮提取量的影响

2.2 正交试验结果

在单因素实验的基础上进行正交试验，试验结果见表3。

表3 正交试验结果

由表3可知，影响总黄酮提取量的四个因素的主次顺序为乙醇浓度>料液比>复合酶比例>超声温度，最佳提取工艺条件为A3B1C3D2，即复合酶比例2∶1、料液比1∶30(g/mL)、乙醇浓度50%、超声温度50 ℃。

2.3 验证实验

对正交试验得到的最佳工艺条件进行验证实验。经过三次平行实验，实际测得总黄酮提取量为12.6 mg/g，与预测值相近，说明工艺优化得到的技术参数是稳定可靠的。

2.4 抑菌试验结果

由表4可知：当稀释浓度倍数高于1/4时，两种细菌均有透明抑菌圈，表明总黄酮提取液对两种细菌均有不同程度的抑制作用；当稀释浓度倍数为1/4时，金黄色葡萄球菌周围几乎没有抑菌圈，随着总黄酮浓度的降低，抑菌圈也减小至无；当稀释浓度倍数为1/8时，没有抑菌效果。由以上结果可以得出，对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度为0.5 mg/mL，对大肠杆菌的抑菌浓度为0.25 mg/mL。

表4 总黄酮提取液抑菌试验结果

3 结论

本研究以东北土当归叶为原料，以乙醇溶液为溶剂，采用复合酶(纤维素酶/果胶酶)协同超声波提取东北土当归叶中总黄酮。通过单因素实验和正交试验，确定最佳提取工艺：复合酶比例2∶1、料液比1∶30 (g/mL)、乙醇浓度50%、超声温度50 ℃。在此条件下，总黄酮提取量达到最大值，为12.6 mg/g。通过抑菌试验证明东北土当归叶总黄酮有良好的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌浓度为0.5 mg/mL，对大肠杆菌的抑菌浓度为0.25 mg/mL。