SIX1、E-cad在子宫内膜增生性病变组织中的表达及意义

朱惠萍 王丽丹

浙江省诸暨市人民医院(311800)

子宫内膜增生中部分病变属子宫内膜癌的癌前病变[1]。子宫内膜增生主要临床特点是月经周期紊乱、不规则阴道流血，降低女性生育能力[2]。寻找子宫内膜增生性病变相关因子，探寻其发病机制，进而制定有效治疗方案，可能对降低癌症发生有重要意义。同源盒基因SIX1是一种多基因家族的转录调节因子，与恶性肿瘤的发生发展关系密切[3]。上皮型黏附素(E-cad)是一类介导同质细胞间黏附的跨膜糖蛋白，对肿瘤的发生、发展、浸润等有重要作用[4]。SIX1、E-cad在子宫内膜增生性病变中的作用有待探究。因此，本研究通过探究单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者内膜组织中SIX1 mRNA、E-cad mRNA及蛋白表达水平，以期为子宫内膜增生性病变发病机制研究及阻止癌变发生提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年12月-2021年3月本院行刮宫术的子宫内膜增生性病变内膜组织159例标本，患者均因不规则阴道流血就诊。纳入标准：①子宫内膜增生性病变患者均符合相关诊断标准[5]，且经术后病理证实；②术前3个月内未接受化疗、放疗、激素类药物治疗；③临床资料完整且自愿参加本研究，研究符合伦理学标准；④无肝脏疾病及其他器官恶性肿瘤者。排除标准：①存在严重内科疾病及免疫代谢性疾病；②生殖器官发育畸形；③妊娠期或哺乳期妇女。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 主要试剂与仪器

总RNA提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司；通用反转录试剂盒购自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自日本Takara公司；Rox reference dye购自武汉纯度生物科技有限公司；免疫组化试剂盒购自德国Roche公司；SIX1抗体购自上海科敏生物科技有限公司；E-cad抗体购自上海信裕生物科技有限公司。qRT-PCR仪(型号：ABI 7700)购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 检测方法

1.3.1样品采集及保存采集单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者行刮宫术时的组织标本，子宫内膜癌患者手术时取正常子宫内膜组织后立即相应处理，保存备用。

1.3.2内膜组织SIX1、E-cad mRNA水平检测采用RNA提取试剂盒提取内膜组织总RNA后反转录得cDNA。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪扩增目的基因SIX1、E-cad和内参GAPDH。反应条件：95℃ 5 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。反应体系：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，ddH2O 3.0 μl，上下游引物(10 μM)各0.4 μl，引物序列见表1。样品重复3次，采用2-△△CT法对受试者内膜组织中SIX1、E-cad mRNA水平进行相对定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3内膜组织SIX1、E-cad蛋白表达检测3组内膜组织标本常规10%甲醛固定，梯度脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，采用免疫组织化学法检测内膜组织SIX1、E-cad蛋白表达情况。依据免疫组化试剂盒说明操作(一抗为SIX1、E-cad抗体)，对组织切片进行染色，以阳性细胞百分数和着色强度评分：以着色强度计分，强着色3分，中等着色2分，弱着色1分，无着色0分；按照阳性细胞百分数计分，阳性细胞>76% 4分，51%～75% 3分，26%～50% 2分，6%～25% 1分，≤5% 0分。两者相加为最终评分，总分≤3分为阴性(-)，>3分为阳性(+)，以蛋白表达阳性率作为最终统计标准。每张切片分别由2名病理科医师判读。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 纳入对象基本情况

159例中，单纯性增生(单纯增生组)81例，年龄(55.9±8.7)岁(42～70岁)；复杂性增生伴非典型增生(复杂增生组)78例，年龄(56.4±8.9)岁(43～71岁)。同期子宫内膜癌患者83例正常子宫内膜组织(经病理学证实)内膜癌组，年龄(56.1±9.0)岁(42～71岁)。3组患者年龄无差异(P>0.05)。

2.2 SIX1、E-cad mRNA水平比较

SIX1 mRNA水平，复杂增生组最高、单纯增生组次之、内膜癌组最低，E-cad mRNA水平复杂增生组最低、单纯增生组次之、内膜癌组最高(均P<0.05)。见表2。

表2 各组SIX1、E-cad mRNA水平比较

2.3 SIX1、E-cad蛋白表达比较

SIX1蛋白表达阳性率复杂增生组最高、单纯增生组次之、内膜癌组最低，E-cad蛋白表达阳性率复杂增生组最低、单纯增生组次之、内膜癌组最高(P<0.05)。见表3、图1、图2(1309页)。

表3 各组SIX1、E-cad蛋白表达情况比较[例(%)]

图1 内膜组织ＳＩＸ１免疫组织化学染色结果（×１００）

图2 内膜组织Ｅ ｃａｄ免疫组织化学染色结果（×１００）

2.4 子宫内膜增生性病变患者SIX1与E-cad mRNA水平相关性

Pearson法分析结果显示，单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者SIX1与E-cad mRNA水平均呈负相关(r=-0.664、-0.572，P<0.05)。见图3、图4(1309页)。

图3 单纯性增生患者ＳＩＸ１与Ｅ ｃａｄｍＲＮＡ水平相关性

图4 复杂性增生伴非典型增生患者ＳＩＸ１与Ｅ ｃａｄｍＲＮＡ水平相关性

2.5 子宫内膜增生性病变患者SIX1与E-cad蛋白表达相关性

Spearman法分析结果显示，单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者SIX1与E-cad蛋白表达均呈负相关(r=-0.354、-0.424，P<0.05)。见表4。

表4 不同增生性患者内膜组织SIX1与E-cad蛋白表达相关性(例)

3 讨论

子宫内膜增生有一定的癌变倾向，因此被列为癌前病变[6]。子宫内膜增生主要分为单纯性增生、复杂性增生、非典型增生，其中单纯性增生一般单独存在[7]。若组织结构为复杂性增生，细胞学上具有非典型改变，则为复杂性增生伴非典型增生[8]。探究子宫内膜增生相关因子，可能对肿瘤的形成和发展有一定的抑制作用。

研究表明，SIX1是一类能调控细胞发生上皮间质转化的因子，可诱发细胞恶性增殖、分化并出现侵袭性，进而在肿瘤的发生发展中起关键作用[9-10]。E-cad不仅调控细胞间黏附，还能直接参与细胞间的信号转导，在许多肿瘤中均表达下调，且一般伴随肿瘤细胞极性消失、浸润能力增强及淋巴结转移率增高[11]。研究表明，E-cad表达下调可启动上皮间质转化，进而造成肿瘤侵袭、转移，是一种上皮标志物[12]。而子宫内膜增生作为一种癌前病变，其发生发展可能与上皮间质转化有密切联系。本研究结果显示，内膜癌正常子宫内膜组织、单纯性增生患者病变内膜组织、复杂性增生伴非典型增生患者病变内膜组织中SIX1 mRNA水平及蛋白表达阳性率依次升高、E-cad mRNA水平及蛋白表达阳性率依次降低，与宁昭芳等[13]、宓淑芳等[14]及Rubesa-Mihaljevic等[15]研究中SIX1、E-cad在子宫内膜癌中的表达趋势一致。提示SIX1高表达、E-cad低表达可能在子宫内膜增生性病变中发挥重要作用。罗方等[16]研究表明，SIX1对E-cad表达有调控作用且以此影响甲状腺细胞侵袭转移。本研究结果中，单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者SIX1与E-cad mRNA水平及蛋白表达均呈负相关。提示SIX1与E-cad在功能上可能存在一定的相关性，推测本研究中单纯性增生患者疾病发展初期，SIX1表达水平升高，而SIX1作为上皮间质转化的转录调控因子调控其下游靶基因的表达，造成E-cad表达水平下降，进而诱导上皮间质转化发生，促进疾病进展为复杂性增生伴非典型增生，且有可能进一步影响肿瘤的发生发展。

综上所述，SIX1、E-cad在单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者病变内膜组织中表达水平分别明显高于、低于内膜癌正常子宫内膜组织，且在复杂性增生伴非典型增生患者中变化更为明显。本研究中单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者SIX1与E-cad存在负相关，二者可能通过负向调控促进子宫内膜增生性病变的发生发展。SIX1、E-cad有望成为一组潜在的子宫内膜增生性病变标志物。但本研究结果可能因样本量较小存在偏倚，今后将结合动物实验及细胞分子实验进一步深入分析。