天麻素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力和前额叶皮质GalR2表达的影响

刘德玲，李怀斌，黄 锐，赵 健

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种神经退行性疾病，以65岁以上老年人多发，学习记忆能力逐渐下降表现较为明显。大量研究表明，海马和前额叶皮质等脑区最易被累及，目前尚无特效治疗方法。甘丙肽(Galanin,Gal)广泛分布于中枢神经系统，参与神经传递和神经内分泌的调节，对神经元的再生和认知记忆等功能具有重要意义，其中甘丙肽受体2(galanin recepter 2,GalR2)是介导Gal发挥神经保护作用的主要受体亚型[1]。天麻素可通过多种途径发挥神经保护作用，减轻AD模型大鼠症状并提高学习记忆能力，但其具体作用机制仍在不断研究中。本研究通过观察天麻素对AD大鼠前额叶皮质的GalR2表达是否有影响，进一步探讨其参与认知功能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SD健康雄性清洁级大鼠40只，体质量190～210 g，由山东省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(鲁)2019-0003。适应性饲养1周后，实验大鼠随机分为正常组(N组)、模型组(M组)、天麻素+甘丙肽受体激动剂(G+M1145)组、天麻素组(G组)、天麻素+甘丙肽受体抑制剂(G+M871)组，每组大鼠数量为8只。

1.2 主要试剂 Aβ1-42，Nissl染色液，M871，M1145，天麻素注射液，二抗，DAB显色剂。

1.3 动物模型制作 N组：不做处理。M组：大鼠予以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(剂量0.1 mL/100 g)，之后将大鼠固定于鼠脑立体定位仪操作台，将头部皮毛剔除，碘伏消毒，沿正中线切开头部皮肤暴露前囟，参照包新民的《大鼠脑立体定向图谱》，于前囟后3.6 mm，中线旁开2.8 mm，深度4.1 mm，将颅骨钻一小孔，用微量进样器在两侧海马分别注射Aβ1-42(剂量5 μL)，每侧注入时间为10 min，留针5 min。G组：造模24 h后，将天麻素注射液按10 mg/kg进行腹腔注射，每日1次，连续3周。G+M871组和G+M1145组：造模24 h后，在进行天麻素腹腔注射治疗的同时，分别予以侧脑室(前囟后0.4 mm，中线旁开1.4 mm，深3.7 mm)注射M871和M1145进行干预1次，剂量10 μL，其余同G组。

1.4 行为学检测 Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力：水池直径1.2 m，深0.6 m，平台直径0.09 m，高度约为0.25 m，将平台隐藏于水面下1～2 cm，距池壁约0.3 m处(本实验将平台放置在第4象限)。测试前1天，将每组大鼠引至平台适应10 s。测试的第1～4天将大鼠分别从4个象限面向水池壁放入水中，每次投放的象限顺序不同，但每个象限的投放点相同。大鼠在平台停留时间超过5 s即可认为找到平台，记录大鼠从入水到在平台停留所需的时间即为逃避潜伏期。如90 s内仍未找到平台，则其潜伏期被记录为90 s。第5天将原平台撤离，记录90 s内大鼠的运动轨迹。

1.5 指标检测 每组中4只大鼠采用Nissl染色和免疫组化方法观察前额叶皮质神经元的形态变化及GalR2免疫反应阳性神经元的数量改变。每组中另外4只大鼠用Western blot法检测前额叶皮质GalR2蛋白的表达。

2 结果

2.1 各组大鼠水迷宫实验结果 与N组比较，M组、G+M871组和G组平均逃避潜伏期均延长(P<0.05)，目标象限停留时间缩短；与M组比较，G组和G+M1145组大鼠平均逃避潜伏期缩短(P<0.05)，目标象限停留时间增加；与G+M871组比较，G组和G+M1145组大鼠平均逃避潜伏期缩短(P<0.05)，目标象限停留时间增加。详见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期和GalR2表达的变化

2.2 各组大鼠Nissl染色结果 N组Nissl染色阳性神经元数量较多，分布较密集；胞体多数呈圆形，核仁清晰可见，突起明显。M组神经元数量较N组减少，呈现胞体皱缩或空泡状、核仁不清、突起减少等形态的改变。与M组比较，G组和G+M1145组神经元数量增多，细胞形态与N组接近，细胞突起较多；而G+M871组神经元数量和形态变化与M组差异不明显。详见图1。

Nissl染色法，×400，标尺30 μm。

2.3 各组大鼠Western blot检测结果 与N组比较，M组和G+M871组前额叶皮质GalR2蛋白的表达量增加(P<0.05)；与M组比较，G组和G+M1145组GalR2蛋白的表达量降低(P<0.05)；与G+M871组比较，而G+M1145组GalR2蛋白的表达量降低(P<0.05)。其他详见图2和表1。

图2 各组大鼠前额叶皮质GalR2蛋白的表达(Western blot法)

2.4 各组大鼠免疫组化染色结果 与N组比较，M组和G+M871组大鼠前额叶皮质区GalR2阳性神经元的数量增加(P<0.05)；与M组比较，G组和G+M1145组GalR2阳性神经元数量减少(P<0.05)；与G+M871组比较，G组和G+M1145组GalR2阳性神经元数量减少(P<0.05)。其他详见图3和表1。

免疫组化染色，×400，标尺30 μm。

3 讨论

AD是老年人中最常见的慢性神经退行性疾病，世界卫生组织预测到2050年全世界将有1.35亿痴呆人群，其中半数以上是AD患者，并且因AD及其引发的并发症导致的死亡人数明显增加[2]。既往对AD发病机制和治疗的研究主要集中在海马区域，而大脑前额叶皮质也参与了人类的高级认知过程[3]，在情景记忆的编码和提取过程中发挥着重要的作用[4]，是大脑新皮质中的重要联络脑区之一[5]。研究发现，AD患者的前额叶皮质较正常人群不仅在结构体积上明显缩小[6]，而且在神经元超微结构上也发生了明显变化[7]，某些神经递质的表达水平也随着改变[8-9]。本研究结果显示，AD模型大鼠前额叶皮质的GalR2表达明显上调，细胞皱缩、核仁不清，细胞突起数量也有所减少，并且大鼠在目标象限停留时间明显缩短，进一步说明该脑区在AD发病过程中被累及，并影响了学习记忆能力。

人Gal是由30个氨基酸残基组成的神经肽，是G蛋白偶联受体家族成员之一，其受体共有三种亚型GalR1～3。GalR1在大鼠的脑和脊髓中都有表达，可参与痛觉传递、肠道分泌和运动等生理过程。GalR2在各个脑区都有分布，在大脑皮层和海马呈现出高表达，在中枢神经系统的发育和损伤修复过程中也有一定的作用，是介导Gal发挥神经保护作用的主要受体亚型[1]。GalR3在中枢神经系统的分布不均，主要对情绪、摄食、痛觉传递和垂体激素的释放等起调节作用[10]。研究发现[11-12]，AD早期脑内的选择性认知区域GalR结合率增加，模型组海马区Gal的表达量升高。Gal可破坏兴奋性胆碱能突触前受体，反馈性减少乙酰胆碱释放，损伤突触可塑性，Gal的过度表达抑制了胆碱传递，限制海马长时程增强，加剧AD的临床表现[13]。但也有观点表明，Gal在中枢神经系统中与乙酰胆碱共同释放，并可刺激海马区胆碱能神经传递，减轻AD症状的发展[11]，Gal的过度表达对促进基底前脑胆碱能神经元生存及功能的基因表达起到正向调节作用[14]。因此，关于Gal在AD中的作用机制仍有争议。

目前AD的发病机制尚不完全明确，国内外也缺少针对AD的有效治疗手段及药物。西医治疗AD以单靶点药物为主，多靶点药物偏少，而中医强调治病求本，在辨证用药的基础上常联合针刺综合治疗，实现多通道干预，从而达到多靶点治疗，具有一定优势。现在中医药在治疗AD方面取得了令人瞩目的成果，中医药防治痴呆是今后发展的一个重要方向[15]。天麻素是一种传统的中草药，因其副作用较少，已被广泛应用于临床许多疾病的治疗，在治疗AD方面也有着很好的疗效[16-17]。研究发现，天麻素在治疗AD过程中可激活Wnt信号通路，缓解Aβ所致的神经损伤，有效发挥了神经保护作用[18-19]。另外，天麻素也可以通过调节胆碱能系统的机能，增强神经细胞突触兴奋性，改善AD大鼠的学习记忆能力[20]。本研究结果显示，天麻素可降低AD模型大鼠前额叶皮质GalR2表达，改善大鼠的学习记忆能力，并在侧脑室注射GalR激动剂或拮抗剂后，大鼠的学习记忆能力也随之改变，提示天麻素可通过调节GalR2的表达水平治疗AD。中药治疗疾病的机制较为复杂，天麻素对神经系统的保护作用通过多个途径发挥，但关于其具体作用机制，尚需进一步深入探讨。