罗非鱼胶原低聚肽对功能性消化不良小鼠胃肠运动与脑肠肽的影响

胡佳妮 刘睿 郝云涛 于晓晨 李臻 刘欣然 珠娜 康家伟 李勇

摘 要：目的：研究罗非鱼胶原低聚肽（TCOPs）对功能性消化不良小鼠胃肠运动与脑肠肽的影响。方法：72只成年雄性ICR小鼠按体重随机分为空白对照组、模型对照组、乳清蛋白组（500 mg/kg BW）和胶原低聚肽低、中、高剂量组（250、500、1 000 mg/kg BW）。模型组和受试物组采用盐酸洛哌丁胺制作小鼠功能性消化不良模型。干预14 d后，进行小肠运动和胃排空功能实验;观察小鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率，测定血清P物质、血管活性肠肽、胃泌素、胃动素含量。结果：TCOPs能明显增加小鼠体重和提高食物利用率，使小鼠墨汁推进率显著增加，胃内残留率明显降低，并使血清GAS、MTL、SP水平显著提高，VIP显著降低。结论：罗非鱼胶原低聚肽能通过提高食物利用率并促进小鼠体重增长，增强小肠蠕动与加速胃排空，调节脑肠肽水平，起到改善小鼠的功能性消化不良的目的。

关键词：罗非鱼胶原低聚肽;消化不良;胃肠运动;脑肠肽

功能性消化不良（FD）是最常見的功能性胃肠疾病之一，影响了全球10%～30%的人口[1]。FD的主要特征是餐后饱胀，早饱或上腹痛以及烧灼感等症状，而没有任何器质性问题可以解释症状。目前，已经提出了许多病理生理机制来解释不同的临床症状，以饱腹、上腹部不适或恶心为特征的胃肠动力障碍和脑-肠相互作用异常被报道为FD患者的主要致病因素[2-3]。中枢神经系统（CNS）或肠神经系统（ENS）的失调可导致胃肠道感觉和运动障碍，影响大脑和肠道双向通讯调节（脑肠轴）在胃肠道中起着重要的生理作用，因此脑肠轴的紊乱在FD的发病机制起着关键作用。脑肠肽被认为是胃肠道局部感觉神经支配的生化标志物，可能与双向肠脑交流有关[4]。肠蠕动依赖于根据Cajal间质细胞（ICC）产生的慢电波，通过平滑肌的有节段性的收缩和松弛进行蠕动[5]。胃排空调节食糜进入十二指肠，当营养物质与小肠粘膜相互作用，从而诱导大量神经递质和激素的释放，然后通过反馈作用来调节胃排空。

由于FD的发病机制尚未确定，临床上的治疗方法主要是对症治疗，包括根除幽门螺杆菌、质子泵抑制剂（PPI）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），三环抗抑郁药（TCA）或促动药[6]，但这些治疗方法存在疗效低、停药后复发率高以及对人体有副作用等局限性。另一方面，寻找能够降低或预防疾病风险的生物活性肽成为了学术热点。许多实验已经报道了生物活性肽类在改善人体健康方面发挥重要作用，在胃肠系统表现为抗胃肠溃疡[7]、润肠通便[8]以及改善肠道菌群作用[9]，但在促消化功能方面报道甚少。胶原蛋白是重要的纤维结构蛋白，补充胶原蛋白是保持人体健康的重要途径，因具有出色的生化和生物相容性特征被生物医学领域广泛应用。近年来，从海洋鱼类的胶原蛋白中获得的低分子量生物活性肽由于具有良好的保湿性、溶解度、吸收率、低变应原性和药理活性，被广泛应用于化妆品、保健食品和药品行业中[10]。我国是罗非鱼的养殖与进出口大国，并且罗非鱼营养价值高，鱼鳞中胶原蛋白含量丰富，是制备胶原蛋白生物活性肽的优质原料[11]。从罗非鱼鳞中利用生物酶解技术得到罗非鱼胶原低聚肽（TCOPs）是一种小分子生物活性肽，因分子量低而具有良好的吸收性，且炎症反应极小，胃肠道耐受性好。本研究评估了不同剂量TCOPs对盐酸诺哌丁胺诱导的FD模型小鼠的主要症状（包括小肠运动异常和胃排空延迟）的作用以及对脑肠肽的影响，为支持TCOPs在胃肠道健康保健与临床促消化的应用提供科学实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级成年雄性ICR小鼠72只，体重18～22 g，许可证号：SYXK（京）2016-0041，由北京大学医学部实验动物中心提供，分笼饲养，饲养于SPF级动物室。实验期间动物自由饮水、进食。

1.2 主要试剂与仪器

TCOPs为白色固体粉末，主要成分为分子量小于1 000 Da的低聚肽，具体分子量分布为<180 Da （9.97%）、180～500 Da （56.06%）、500～1 000 Da（26.67%），海南盛美诺生物技术有限公司;盐酸洛哌丁胺胶囊，西安杨森制药有限公司;印度墨水，北京宝瑞杰科技有限公司;小鼠GAS、MTL、SP、VIP试剂盒，上海蓝基生物科技有限公司;高速冷冻离心机，德国EPPendorf公司;MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪，美国Thermo公司;DH4000A电热恒温培养箱，天津泰斯特。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组与处理 适应性喂养1 w后，ICR小鼠按照体重随机分为6组：空白对照组、模型对照组、乳清蛋白组和胶原低聚肽低、中、高剂量组。每日1次灌胃给予受试样品，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水，乳清蛋白组和核桃肽组给予相应浓度受试物，胶原低聚肽和乳清蛋白溶液均用蒸馏水配制。灌胃量按10 mL/kg体重计算，每周按体重调整受试样品剂量。ICR小鼠干预周期为14 d。分别进行以下实验。

1.3.2 体重、体重增重、摄食量和食物利用率实验[14]干预期间每周测ICR小鼠的体重和食物摄入量，14 d干预结束后计算小鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率。

1.3.3 小肠运动实验[14，16] 小鼠实验结束前禁食不禁水16 h，实验当天各剂量组再给予一次受试样品，30 min后各实验组和模型对照组给予盐酸洛哌丁胺（剂量：5 mg/kg）[17]进行造模，空白对照组给予蒸馏水，30 min后各组再给予墨汁，25 min后麻醉状态下脱颈处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门至回盲部的肠管，置于托盘上轻轻拉直，测量肠管长度为“小肠总长度”，由幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式（1）计算墨汁推进率，以评价小肠运动功能。

墨汁推进率（%）=墨汁推进率小肠总长度×100%（1）

1.3.4 胃排空功能实验[12-13] 暴露小鼠腹腔，结扎胃贲门和幽门取胃，用滤纸拭干后称重胃总质量，沿胃大弯剪开胃部，4 ℃生理盐水冲洗去胃内容物后拭干，称重胃净质量，计算胃内容物残留率，以评价小鼠胃排空功能。

胃内容物残留率（%）=胃总质量-胃净质量墨汁质量×100%（2）

1.3.5 胃肠激素水平的测定 小鼠末次灌胃后，眼眦取血，混匀，常温放置15 min，冷藏于4 ℃，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，即血清。按照酶联免疫测试盒的使用方法对小鼠血清胃泌素、MTL、VIP、P物质进行测定。

1.4 统计方法

正态数据均以平均值±标准差（±s）表示，采用IBM SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，差异显著者进行方差齐性检验，方差齐者以LSD法对多组平均值之间的差异进行分析，方差不齐者以Dumnett’s T3法对多组平均值进行post-hoc分析。对方差不齐者用非参数检验Kruskal-allis法确定统计学差异。以P<0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 TCOPs对小鼠体重影响

在用TCOPs给小鼠连续喂养的14 d中，观察到TCOPs干预组的小鼠每周的体重增长趋势较对照组小鼠更为明显;喂养结束时，TCOPs中、高剂量组小鼠体重明显高于空白对照组（P<0.05），其中TCOPs高剂量组小鼠体重增长效果最显著（表1）。

2.2 TCOPs对小鼠摄食量和食物利用率的影响

在用TCOPs喂养干预14 d后，TCOPs低、中、高剂量组体重增重呈现递增趋势，与对照组相比，TCOPs各剂量组体重增重均明显提高（P<0.05）;在摄食量方面，各实验组间无显著差异（P >0.05），但TCOPs各剂量组食物利用率明显高于空白对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3 TCOPs对小鼠肠推进功能的影响

相对于空白对照组，模型对照组小鼠的墨汁推进长度和墨汁推进率显著降低，（P<0.01），这说明小鼠造模成功。与模型对照组比较，TCOPs低剂量组小鼠墨汁推进率明显增加（P<0.05），TCOPs中、高剂量组小鼠墨汁长度和推进率显著增加（P<0.01）;相对于乳清蛋白组，TCOPs高剂量组小鼠墨汁推进率明显增加（P<0.05）（表3）。

2.4 TCOPs对胃排空功能的影响

相对于空白对照组，模型对照组小鼠的胃内残留率显著提高（P<0.01），这说明小鼠胃排空障碍模型构建成功。TCOPs各干预组小鼠胃内残留率随剂量的增加呈递减趋势;与模型对照组比较，TCOPs高剂量组胃内残留率明显减低（P<0.05）（表4）。

2.5 TCOPs对小鼠脑肠肽的影响

相比于空白对照组，模型对照组小鼠血清GAS、MTL、SP含量明显下降，VIP含量明显上升。与模型组相比，TCOPs高剂量组小鼠血清GAS、MTL、SP含量明显升高（P<0.05），VIP含量明显降低（P<0.05）（表5）。

3 讨论

盐酸洛哌丁胺是一种μ阿片受体激动剂，阻断胃肠道的μ阿片受体和拮抗钙调蛋白是洛哌丁胺影響肠动力作用的两个主要分子机制[14-15]。盐酸诺哌丁胺已被用于在啮齿动物模型中引起消化不良症状，在最近的研究中，洛哌丁胺可导致小鼠中的胃排空延迟和肠动力降低[16-17]。此外，本次实验设置了乳清蛋白组作为阳性对照，以消除额外摄入蛋白质对本研究的影响。

进入胃肠道的食物和营养物质在经机械性和酶类的化学性消化的共同作用后，变成可吸收的小分子物质被机体利用以促进生长，因此消化功能与体重、摄食量和食物利用率密切相关[18]。观察小鼠每周体重的变化趋势，经TCOPs灌胃干预的小鼠体重增速较快，喂养结束时，TCOPs组小鼠体重与空白对照组小鼠体重相比存在显著差异，TCOPs可以明显促进小鼠的体重增长与提高食物利用率。小肠运动实验和胃排空实验结果显示，模型对照组小肠墨汁推进率明显低于空白对照组，胃内残留率显著高于空白对照组，说明小鼠功能性消化不良模型造模成功。胃排空是食物进入十二指肠的过程，大多数FD患者患有胃肠动力障碍，这与胃排空延迟有关[19]。一项以胃电图为基础的临床研究发现，延迟的肠道运动与胃排空障碍之间存在密切联系[20]。本次实验中，TCOPs干预组相较于模型对照组小肠墨汁推进率明显提高，其中高剂量组墨汁推进效果尤为显著。胃排空方面，TCOPs高剂量组小鼠的胃内残留率明显低于模型对照组，提示TCOPs不仅可以显著增强小肠节律性蠕动，还具有增强胃排空功能的作用。

GAS是幽门腺某些细胞分泌的多肽激素，强烈刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，并轻度刺激胰酶的分泌和胆囊的收缩[21]。MTL的主要功能是增加GI运动的迁移的肌电复合物成分、刺激胃蛋白酶的分泌并促进肠道蠕动，并且MTL水平的变化与胃排空异常密切相关[22-23]。所有这些表明，MTL水平降低会通过减弱胃肠道的运动性诱发消化不良。VIP是一种从ENS释放到许多胃肠道区域的重要脑肠肽，它参与胃肠的分泌和运动，并具有血管舒张作用，可以通过放松平滑肌，抑制圆形平滑肌层的蠕动反射，延迟胃排空并减慢小肠蠕动[24-25]。SP是速激肽神经肽家族的成员，不平衡的速激肽能系统会导致胃肠运动和分泌紊乱。有研究显示，在FD患者中，胃窦SP浓度与胃胀时的不适和痛觉阈值呈显著负相关[26]。本研究结果发现，TCOPs通过增加GAS、MTL、SP和降低VIP等脑肠肽的产生，以调节对胃肠道运动和分泌，缓解FD症状。

4 结论

综上所述，本项研究通过建立功能性消化不良小鼠模型探讨TCOPs对FD小鼠胃肠运动和脑肠肽的影响，结果显示TCOPs能明显促进小鼠体重和食物利用率增长，增进小肠推进率，减少胃内残留率。同时，TCOPs对功能性消化不良小鼠GAS、MTL、SP与VIP具有调节作用，通过影响脑肠肽上调脑肠轴，纠正胃肠道激素紊乱。TCOPs通过以上机制具有增强胃肠蠕动与促消化的作用，表明TCOPs具有治疗FD的潜力，但相应的效果需要在人群试验中进行更为深入的探讨与验证。◇

参考文献

[1]Mahadeva S，Goh KL.Epidemiology of functional dyspepsia：a global perspective[J].World J Gastroenterol，2006，12（17）：2661-2666.

[2]Scolapio JS，Camilleri M.Nonulcer dyspepsia[J].The Gastroenterologist，1996，4（1）：13-23.

[3]Zeng F，Qin W，Liang F，et al.Abnormal resting brain activity in patients with functional dyspepsia is related to symptom severity[J].Gastroenterology，2011，141（2）：499-506.

[4]毛兰芳，汪龙德，张宏伟，等.功能性消化不良与脑肠肽的研究进展[J].世界华人消化杂志，2015，23（4）：570-576.

[5]Sanders KM.A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract[J].Gastroenterology，1996，111（2）：492-515.

[6]Tack J，Camilleri M.New developments in the treatment of gastroparesis and functional dyspepsia[J].Current Opinion in Pharmacology，2018（43）：111-117.

[7]王志聪，等.鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用[J].中国海洋药物，2012，31（5）：17-22.

[8]张亭，等.核桃低聚肽润肠通便功能作用[J].中国公共卫生，2019，35（9）：1225-1228.

[9]帕力万.利拉鲁肽对糖尿病大鼠肠道菌群的影響[D].北京：北京协和医学院，2015.

[10]Li DD，et al.Protective effects of collagen polypeptide from tilapia skin against injuries to the liver and kidneys of mice induced by d-galactose[J].Biomed Pharmacother，2019（117）：109204.

[11]农业部渔业渔政管理局.中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2017.

[12]卫生部.保健食品检验与评价技术规范2003年版[S].2003.

[13]齐美欣，等.柴胡疏肝散有效部位对功能性消化不良大鼠胃肠动力的影响[J].中药药理与临床，2019，35（3）：15-19.

[14]Merritt JE，Brown BL，Tomlinson S.Loperamide and calmodulin[J].Lancet，1982，1（8266）：283-283.

[15]姚一博，王迪，王钱陶，等.盐酸洛哌丁胺诱导的小鼠慢传输型便秘模型的实验研究[J].中国实验动物学报，2020，28（3）：370-375.

[16]Lee MC，et al.Effects of Lizhong Tang on gastrointestinal motility in mice[J].World Journal of Gastroenterology，2016，22（34）：7778-7786.

[17]Nam Y，et al.The effect of Flos Lonicerae Japonicae extract on gastro-intestinal motility function[J].Journal of Ethnopharmacology，2016（179）：280-290.

[18]马方励，沈雪梅，时军.党参多糖对实验动物胃肠道功能的影响[J].安徽医药，2014，18（9）：1626-1630.

[19]Guo WJ，et al.Impaired vagal activity to meal in patients with functional dyspepsia and delayed gastric emptying[J].J Int Med Res，2018，46（2）：792-801.

[20]Chen JD，et al.Abnormal gastric myoelectrical activity and delayed gastric emptying in patients with symptoms suggestive of gastroparesis[J].Dig Dis Sci，1996，41（8）：1538-1545.

[21]Iijima K，et al.Cutoff serum pepsinogen values for predicting gastric acid secretion status[J].Tohoku J Exp Med，2014，232（4）：293-300.

[22]Liu Y，et al.Effect of Zhizhuwan on gastrointestinal peptide concentrations in plasma of diabetic gastroenteropathy with constipation patients[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2008，33（24）：2966-2968.

[23]胡淑娟，等.舒胃湯对功能性消化不良大鼠Cajal间质细胞、胃动素表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：170-173.

[24]Martins AB，et al.Oxytocin participates on the effects of vasoactive intestinal peptide on food intake and plasma parameters[J].Mol Cell Biochem，2018，437（1-2）：177-183.

[25]张海燕，等.脾虚证模型大鼠血清中血管活性肠肽和胆囊收缩素的变化及四君子汤的干预作用[J].吉林中医药，2014，34（6）：609-611.

[26]Lee MJ，et al.Pharmacological profile of DA-6886，a novel 5-HT4 receptor agonist to accelerate colonic motor activity in mice[J].European Journal of Pharmacology，2014（735）：115-122.

Effect of Tilapia Collagen Oligopeptide on Gastrointestinal Motility

and Brain Intestinal Peptide in Mice with Functional Dyspepsia

HU Jia-ni，LIU Rui，HAO Yun-tao，YU Xiao-chen，LI Zhen，LIU Xin-ran，ZHU Na，KANG Jia-wei，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To evaluate the effects of tilapias collagen oligopeptide（TCOPs）on gastrointestinal motility and brain intestinal peptide in mice with functional dyspepsia.Method Totally 72 adult male ICR mice were randomly divided into blank control group，model control group，whey protein group （500 mg/kg BW）and low，medium and high dose group （250，500，1 000 mg/kg BW）.The functional dyspepsia model of mice was made by loperamide hydrochloride in the model group and the subjects group.After 14 days of intervention，the small intestine movement and gastric emptying function were tested to observe the weight，weight gain，food intake and food utilization of mice，and determine serum P substances，vasoactive intestinal peptide，gastrin，motilin content.Result TCOPs could significantly increase the weight and the food utilization rate of mice，and significantly increase the ink propulsion rate，significantly reduce the gastric residual rate，and significantly increase the serum GAS，MTL，SP levels while VIP levels reduced in the TCOPs group.Conclusion TCOPs can improve food utilization and increase weight gain in mice，enhance small intestinal motility and accelerate gastric emptying，and regulate the level of brain-gut peptide，to improve functional dyspepsia in mice.

Keywords：tilapia collagen oligopeptide;dyspepsia;gastrointestinal motility;braingut petide