Ⅲ型效应蛋白XopAY调控水稻白叶枯病菌的致病力

占昭宏，林玉暖，米 多，魏炳铮，牛晓磊，陈银华，陶 均，李春霞

（海南大学 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室/热带作物学院，海口 570228）

水稻白叶枯病是由水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的一种破坏性极大的病害,长期以来对水稻的产量造成巨大的损失。在病原菌与水稻的互作过程中，水稻细胞可识别来自病原菌的信号分子从而触发免疫防御，而病原菌也进化出特殊的机制来抑制或逃脱宿主产生的免疫反应而成功侵染。在此过程中，由Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ Secretion System, T3SS)分泌的效应因子(Type Ⅲ Secretion Effectors, T3SEs)起到关键性的作用。一方面，部分T3SEs可抑制植物细胞的天然免疫途径而起到促进细菌侵染的作用；另一方面，植物进化出了一些新防御策略：植物细胞可识别部分T3SEs而触发免疫反应，限制病原菌的侵染。在反复的斗争过程中，细菌又进化出了部分T3SEs来抑制由效应因子激活的免疫反应。此过程循环往复，病原菌与植物协同进化，共同决定病原菌与植物的关系[1−2]。因此，解析T3SE的功能及调控途径对理清病原菌−植物的互作关系至关重要。通过泌出信号肽氨基酸组成、保守结构域与结构的无序性、HrpX和HrpG是否调控、GC含量和密码子偏好性以及同源性等分析是预测效应蛋白的主要手段[3]。Xoo中有2类T3SEs：一类是转录激活子类效应蛋白(Transcription Activation-Like Effectors, TALEs)，可与水稻易感性基因启动子的结合调控宿主基因表达[4−6]，但并不是所有Xoo菌株都有TALE。另一类是非TALE效应因子。这类T3SEs结构多变，功能多样。XooPXO99A中，共有19个TALEs以及32个非TALE效应因子。在TALE类效应因子中，PthXo1、PthXo2和PthXo3的功能被研究得比较清晰[7−11]。在32个非TALE效应因子中，9个(XopK、XopP、 XopR、 XopY、 XopZ、XopN、XopF、XopV和XopAA)的功能已被研究，被认为参与PTI途径(pathogen-associated molecular pattern triggered immunity)，抑制活性氧以及调控细胞壁参与的免疫响应等过程[12−13]，但是其中绝大多数的分子机制仍然不清楚[14]。因此，本实验研究了转录因子HrpG，HrpX调控效应因子XopAY的表达情况和xopAY缺失对Xoo致病力的影响，旨在为水稻白叶枯病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料XopAY蛋白序列下载于NCBI，PXO99A为本实验室保存；化学试剂购自广州化学试剂公司和Sigma-Aldrich；PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；限制性内切酶及高保真酶购自NEB China。本实验的引物见表1，所用菌株和质粒见表2。

表1 实验引物Tab. 1 Primer sequences

表2 实验菌株和质粒Tab. 2 Bacterial strains and plasmids

1.2 基因敲除及致病力分析缺失突变体构建及Xoo致病力参照以前发表的方法[15]。PCR扩增xopAY上下游各约500 bp片段，上下游片段分别用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRⅠ酶切回收后连接HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pK18mobsacB，测序正确后通过电击法转入PXO99A中，两步交换后通过PCR验证获得相应突变体。Xoo菌株致病力分析采用剪叶法，水稻为60 d IR24苗，每个菌株接种10片叶，14 d后观察发病情况并量病斑长度。

1.3 互补菌株的构建PCR扩增全长xopAY，通过无缝克隆的方式连接到pHM1载体（HindⅢ/EcoRⅠ酶切）上，测序正确后电击转化∆xopAY，利用壮观霉素筛选转化子，PCR分析是否转化成功[16]。

1.4 RNA提取及RT-qPCR分析PXO99A、∆hrpG、∆hrpX接种于PSA培养基中（w=1%牛肉膏，w=1%酵母提取物，w=1%蔗糖）中，28 ℃培养18 h后，离心收集菌体，将培养基换成Ⅲ型分泌系统诱导型培养基XOM2（0.18% Xylose，670 mmol·L−1Mothionine，10 mmol·L−1sodium glutamate，14.7 mmol·L−1KH2PO4，40 μmol·L−1MnSO4，240 μmol·L−1Fe(Ⅲ)-EDTA，5 mmol·L−1MgCl2，pH6.5），在28 ℃培养箱中诱导培养5 h，离心收集菌体，液氮速冻后进行RNA提取。RNA提取采用TIANGEN公司RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取盒，提取方法参照试剂盒说明书提取。反转录采用Thermo公司的maxima H minus First Strand cDNA synthnesis Ki。以反转录的cDNA为模板进行RT-qPCR和RT-PCR。qPCR试剂用Vazyme公司的ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix。以gyrB基因为内参。qPCR引物见表1。

1.5 数据分析及作图接种数据采用GraphPad Prism 5作图，图像后期处理用Adobe Photoshop 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 XopAY的生物信息学分析植物病原菌T3SEs大多受转录因子HrpG和HrpX调控。HrpG激活hrpX的转录，HrpX结合到植物诱导启动子盒（plant inducible promoter，PIP-box）上促进相关基因转录。HrpX结合的保守序列特征是：TTCGB-N(15)-TTCGB-N(30-32)-YANNRT (B代表C、G、T；Y代表C、T；R代表A、G、T)。通过分析发现，xopAY启动子区域有1个保守的PIP-box及HrpX结合位点（图1-A），暗示xopAY可能是T3SEs。

图1 XopAY为预测的T3SEFig. 1 XopAY is a putative T3SE

T3SEs蛋白通常由2部分组成：N端分泌转运信号区（在前50氨基酸内）和C端功能区域。在XopAY的蛋白序列中，N−端第3个氨基酸序列为P氨酸，且脯氨酸和丝氨酸占N−端前50个氨基酸的百分比为18%，N−端前12位没有天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）（图1-B），这些符合Ⅲ型效应蛋白的特征[3,17]。此外，XopAY不含有转录因子激活结构域。以上分析说明，XopAY应该为典型的非TALE类T3SE。

2.2 xopAY的表达受HrpG和HrpX调控由于xopAY启动子含有保守的PIP-box，为此推测其表达受HrpG和HrpX调控。因此，笔者分析了野生型、hrpG和hrpX突变体中xopAY的表达情况。RT-qPCR)和反转录-PCR（RT-PCR）结果显示，突变hrpG和hrpX均导致xopAY表达量急剧降低（图2A），xopAY在野生型中的表达量约是突变体ΔhrpG和ΔhrpX中的5倍，且RT-PCR的结果显示，xopAY在ΔhrpG和ΔhrpX的PCR条带相对在野生型中暗淡和微弱（图2B）。说明XopAY在Xoo中的表达受HrpG和HrpX正调控[18]。

图2 HrpG和HrpX正调控xopAY的表达Fig. 2 xopAY expression is positively regulated by HrpG and HrpX

2.3 XopAY调控Xoo与水稻的互作上述实验说明XopAY为T3SE。通常T3SE通过调控宿主细胞功能来影响病原菌与宿主的互作，因此，笔者检测了xopAY突变对XooPXO99A致病力的影响。如图3A所示，接种后病斑长度越长代表致病力越强，与野生型PXO99A相比，xopAY缺失突变体致病力显著下降。通过互补分析发现，反式导入xopAY可以恢复ΔxopAY的致病力到野生型水平（图3B）。实验结果表明，XopAY对Xoo侵染水稻非常重要。

图3 XopAY参与Xoo与水稻的互作Fig. 3 Pathogenicity analysis of PXO99A, ΔxopAY, and C-ΔxopAY

3 讨 论

本研究通过生物信息学预测了XopAY作为Xoo候选效应因蛋白，通过构建xopAY的缺失突变体以及回补菌株对水稻叶片进行接种，发现XopAY在Xoo侵染水稻的过程中起到至关重要的作用，在缺失xopAY的情况下，Xoo的致病能力显著下降。本实验结果验证了xopAY受T3SS的重要调控因子HrpG和HrpX的调控。这些结果表明，XoPAY对Xoo的成功侵染起重要作用。虽然在不同病原菌中有很多效应因子被报道参与其致病过程，且机制清晰[12−17]，但XoPAY蛋白鲜见报道，说明其为新型效应因子，具体功能尚不清楚。此外，XopAY通过干预水稻细胞的何种信号或代谢途径进而影响病原菌的致病力仍然未知。今后还有侍鉴定XopAY的生化活性，分析其影响植物细胞功能的方式、途径及调控机制，以便进一步解析Xoo与水稻的互作机制。