prospero同源框 1下调对人胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响

张兴业，田博，郭少春，贺延莉

空军军医大学唐都医院1神经外科，2放射科，西安 710038

prospero同源框1（prospero homeobox 1，PROX1）是Prospero基因相关的转录因子，属于同源盒转录因子中的一员，在哺乳动物各器官包括中枢神经系统的发展中起着至关重要的作用。它通过不同的转录调控方式控制细胞的增殖和分化，具有致癌或抑癌功能。研究发现，PROX1可调控食管癌、口腔癌、小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤的发展。早期研究显示，PROX1在胶质瘤细胞株中表达，且其表达与胶质瘤病理分级呈正相关。然而PROX1在胶质瘤细胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PROX1对胶质瘤细胞生物学功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料

正常人胶质细胞系HEB购自中国科学院广州生物医药与健康研究院；人胶质细胞瘤细胞（glioblastoma，GBM）系 A172（GBM，Ⅳ级）、U87MG（GBM，Ⅳ级）、U-118MG（GBM，Ⅳ级）、SHG-44（GBM，Ⅳ级）和U251（GBM，Ⅳ级）均购自中科院细胞库。DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂盒和Lipofectamine™2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国R&D公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司。PROX1引物、GAPDH引物均由中国上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、N-钙黏蛋白（N-cadherin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司；PROX1 siRNA、scramble siRNA均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养

细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时进行传代。

1.3 转染及分组

将细胞接种于6孔板，待融合率达80%，将细胞分为对照组、scrambled siRNA组和PROX1 siRNA组。PROX1 siRNA组用Lipofectamine™2000将PROX1 siRNA转染细胞，scrambled siRNA组转染scrambled siRNA，作为阴性对照。

1.4 MTT法检测细胞增殖

将转染后的细胞接种于96孔板中（3×10/孔），37℃连续培养96 h。分别于24、48、72、96 h向每孔加入MTT 20 μl（5 mg/ml），4 h后，弃掉培养基，每孔加入100 μl二甲基亚砜，振荡10 min溶解沉淀，用酶标仪于490 nm处检测吸光度（A）值。

1.5 Transwell法检测细胞侵袭

将细胞（1×10/孔）接种于无血清培养基，Matrigel胶铺于Transwell小室上表面，上室加入200 μl细胞悬液，下室加入600 μl常规培养基，24 h后取出小室，弃去上室液体，用棉球擦尽上室的未穿膜细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗后，用甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，清洗后显微镜下随机选取5个视野计数，计算平均值。

1.6 Western blot法检测蛋白表达

收集各组细胞，提取细胞总蛋白，并用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度，取等量蛋白20 μl进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗人PROX1（1∶2000）、E-cadherin 抗体（1∶500）、N-cadherin抗体（1∶1000）、Vimentin抗体（1∶1000），4℃孵育过夜。TBST漂洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5000），室温反应2 h。TBST漂洗后加入增强型化学发光试剂采用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法显色发光，观察蛋白表达。用Image J软件对结果进行灰度值分析并定量。以β-actin为内参。

1.7 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction ，qRT-PCR）检测PROX 1 mRNA表达

用Trizol试剂提取细胞总RNA，将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板荧光定量PCR扩增。引物序列如下：PROX1上游引物5'-AAAGCAAAGCTCATGTTTTTTTATA-3'，下游引物5'-GTAAAACTCACGGAAATTGCTAAA-3'；GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR反应条件：95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 PROX 1蛋白和mRNA表达水平的比较

Western blot和qRT-PCR检测结果显示，PROX1在人胶质瘤细胞A172、U87MG、U118MG、SHG-44和U251中蛋白和mRNA的表达水平均高于正常人胶质细胞HEB，且U118MG和U87MG细胞中PROX1蛋白和mRNA表达水平均高于其他人胶质瘤细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 人胶质瘤细胞和正常人胶-质细胞中PROX 1 mRNA和蛋白表达水平的比较（±s）

2.2 转染后PROX 1蛋白和mRNA表达水平的比较

对照组与scramble siRNA组U118MG和U87MG细胞中PROX1蛋白和mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；PROX1 siRNA组U118MG和U87MG细胞中PROX1蛋白和mRNA的表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 各组 U118MG和 U87MG细胞中PROX 1 mRNA和蛋白表达水平的比较（±s）

2.3 细胞侵袭情况的比较

Transwell侵袭结果显示，PROX1 siRNA组U118MG和U87MG细胞侵袭数目分别少于对照组和scrambled siRNA组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 各组 U118MG和 U87MG细胞侵袭数目比较（±s）

2.4 细胞增殖情况的比较

MTT结果显示，不同时间点scrambled siRNA组和对照组U118MG和U87MG细胞增殖能力比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在72、96 h，PROX1 siRNA组U118MG和U87MG细胞增殖能力低于scrambled siRNA组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

表4 不同时间点各组 U118MG和 U87MG细胞增殖情况比较（±s）

2.5 PROX 1基因沉默对 U118MG细胞和 U87MG细胞上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响

Western blot检测U118MG和U87MG细胞中EMT标志蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达，结果发现，PROX1 siRNA组U118MG和U87MG细胞中E-cadherin表达水平均明显高于对照组，N-cadherin和Vimentin表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表5）

表5 对照组和PROX 1 siRNA组 U118MG和 U87MG细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达水平的比较（±s）

3 讨论

近年来，随着分子生物学研究的进步，寻求胶质瘤生物学特性相关的分子靶点成为治疗胶质瘤新的突破点。本研究比较了A172、U87MG、U118MG、SHG-44和U251 5种人胶质瘤细胞和正常人胶质细胞中PROX1 mRNA和蛋白的表达，发现U87MG和U118MG细胞PROX1表达显著高于其他4种，故选择此二者细胞为研究对象。PROX1基因是胚胎发育和中枢神经系统发育的一个关键转录因子，与调控细胞周期和祖细胞分化密切相关。通过PROX1 siRNA沉默U87MG、U118MG细胞中PROX1的表达，MTT结果发现PROX1 siRNA组细胞生长能力降低，表明PROX1可促进胶质瘤细胞增殖，提示PROX1可能影响胶质瘤细胞的生长。

恶性胶质瘤因其侵袭性强，易造成手术治疗不彻底和复发。Transwell侵袭试验发现PROX1低表达降低胶质瘤细胞侵袭。肿瘤的侵袭转移过程极其复杂，EMT是肿瘤细胞浸润和转移的重要机制之一。既往相关研究结果显示，乳腺癌组织中PROX1的表达量较癌旁组织降低，其机制可能为乳腺癌组织中PROX1基因自身转录沉默，同时其第一内含子的CpG岛呈高度甲基化，进而导致PROX1表达下调。并且在其与病理特征关系的研究中显示，PROX1低表达与肿瘤细胞淋巴结转移及分化程度有关，均提示其参与了肿瘤细胞的侵袭与转移。为研究PROX1对胶质瘤细胞侵袭作用的机制，本研究检测了EMT相关蛋白表达。发现转染PROX1 siRNA能显著上调E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达，表明PROX1 siRNA加强肿瘤细胞黏附，降低细胞对周围基质侵袭。PROX1下调可能通过抑制EMT来抑制胶质瘤细胞侵袭，提示下调PROX1基因在胶质瘤细胞中的表达可能是抑制胶质瘤转移的有效途径，为胶质瘤的抗转移治疗提供了实验基础。

目前已经证实WNT、Notch和细胞外信号调 节 激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）等多条信号通路参与胶质瘤细胞转移，但具体机制尚待进一步研究明确。此外，Risebro等发现，血液系统恶性肿瘤中由于PROX1基因沉默或基因突变导致PROX1表达下调，可能与PROX1基因的启动子甲基化有关，同时提出PROX1基因沉默表达可抑制血液系统恶性肿瘤增殖。此观点较为支持本研究结果。同时，受到样本量较小及检测方式单一化的影响，今后拟扩大样本量并联合多种检测方式，以进一步探讨PROX1影响胶质瘤转移的机制。

综上所述，PROX1在胶质瘤细胞中高表达，可促进胶质瘤细胞的增殖，有望成为胶质瘤基因治疗的潜在靶点。