G 蛋白耦联受体激酶2 参与炎症痛的研究进展

李晓晨（综述） 陈 愈 王彦青 毛应启梁（审校）

（复旦大学基础医学院中西医结合学系 上海 200032）

炎症痛是一种临床常见的疼痛类型。全球大约有两千万例类风湿性关节炎患者，从1990 年至2017 年增加了 7.4%［1］。2017 年全球大约有 3 亿骨关节炎患者［2］，我国膝关节症状性骨关节炎的患病率为8.1%［3］，美国关节炎患者中约有四分之一伴有严重的关节疼痛［4］。美国20~69 岁成年人中炎症性背痛的患病率大约为5%~6%［5］。目前药物治疗以非甾体类抗炎药、阿片类药物为主，但非甾体类抗炎药往往具有胃肠和心血管等方面的副作用，并且不能有效治疗较高强度的疼痛，故阿片类镇痛药由于其副作用、耐受性和依赖性，临床应用受到一定的限制。G 蛋白耦联受体激酶2（G-protein-coupled receptor kinase 2，GRK2）广泛表达于各种组织中，已有研究表明GRK2 在急性炎症痛转为慢性炎症痛的过程中发挥重要作用，脊髓或DRG 神经元内过表达GRK2 可以缓解慢性炎症痛。目前尚无这方面的中文综述，故本文就近年来GRK2 在炎症痛中的作用研究进行总结，以期为炎症痛的机制研究及新药开发提供参考。

GRK2 的结构、分布及功能GRK2 最初被称为β-肾上腺素能受体激酶1（β-adrenergic receptor kinase 1，βARK-1），是 GRKs 家 族 成 员 之 一［6］。GRK2 的结构类似于其他GRKs，由3 个主要的结构域组成：中央激酶结构域、氨基末端区域和羧基末端区域。氨基末端区域旁有G 蛋白信号调节区域［7］，羧基末端区域有 Pleckstrin Homolgy（PH）结构域（ 图 1）。 磷 脂 酰 肌 醇 4，5- 磷 酸 氢 盐（phosphatidylinisitol 4，5-bisphosphate，PIP2）和游离的 Gβγ 亚基通过与 GRK2 的 PH 结构域相互作用，使胞质GRK2 转位到细胞膜上，从而发挥激酶调控作用［6-9］。GRK2 在哺乳动物心脏、血管内皮细胞、脑、肾近曲小管、肺、肝脏和骨骼肌等组织中均有表达，在神经和免疫系统中高水平表达［10-11］。在脊髓中，GRK2 在背角浅层表达水平相对较高［12］。在脑内，GRK2 mRNA 几乎均匀地分布于皮层各层，在丘脑、海马、黑质致密区、腹侧被盖区和蓝斑等核团也都有分布［13］。

GRK2 的主要功能是调节激动剂诱导的G 蛋白耦联受体快速脱敏及信号转导，保护细胞免受过度刺激。 G 蛋白耦联受体（G-protein-coupled receptors，GPCRs）是最大的信号蛋白家族，许多参与疼痛的神经递质通过GPCRs 传递信号。外周伤害性感受器上的GPCRs 能够感知包括前列腺素、组胺、腺苷等在内的多种激活分子，促使初级传入神经元的中枢末端释放谷氨酸、P 物质和降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）等神经递质，激活脊髓背角投射神经元上的GPCRs，使得疼痛信号得以传递至大脑［14］。有证据表明，痛觉过敏和机械性痛觉超敏与GPCRs 的敏感性增加有关，如沙鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）模型足底注射 NK-1 受体激动剂可以增强痛觉过敏［15］。而当GPCRs 被激活时，GRK2 能够磷酸化GPCRs 的丝氨酸/苏氨酸位点，导致GPCRs 与G 蛋白解耦联，招募抑制蛋白βarrestin 与 GPCRs 结 合 ，从而导致 GPCRs 的 快 速 脱敏［16-17］（图 1）。GRK2 水平的改变可以调节与疼痛相关的GPCRs 的反应性，GRK2 水平升高促进一系列GPCRs 脱敏，使得细胞对激动剂的反应降低，相反，GRK2 水平降低导致 GPCRs 激活延长［12］。

图1 GRK2 的结构与GRK2 介导的受体脱敏Fig 1 The structure of GRK2 and GRK2-mediated receptor desensitization

除此之外，GRK2 还可以直接和细胞内信号分子如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成员、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路相关分子、细胞骨架蛋白相互作用［11］。有研究表明，GRK2 通过丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogenactivated protein kinase kinase，MEK）/细胞外信号调 节 激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路调控C-C 趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）诱导的 ERK 激活［18］。GRK2 通过和 PI3K 形成胞质复合物参与激动剂诱导的 PI3K 向细胞膜募集的过程［19］；另外，已有研究证明GRK2 可以结合并磷酸化几种非受体底物，包括突触核蛋白、光导蛋白、埃兹蛋白和微管蛋白［10］。这使得 GRK2 可以不依赖于 GPCRs，直接调节细胞内信号传导［20］。

GRK2 与炎症痛已有临床研究表明，与健康对照相比，类风湿性关节炎或多发性硬化症患者外周血单核细胞的GRK2 蛋白水平降低；同样在类风湿性关节炎或多发性硬化的动物模型中，脾细胞GRK2 蛋白水平也降低［21］。在基础研究中，越来越多的研究表明GRK2 参与了急性炎症痛转为慢性的过程。与对照组相比，初级感觉神经元和脊髓小胶质细胞内 GRK2 都显著降低［20，22］。在角叉菜胶、C-C趋化因子配体 3（C-C motif chemokine ligand 3，CCL3）、白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、肾上腺素（epinephrine，EPI）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）诱导的炎症痛模型中，GRK2+/-小鼠的痛觉过敏可延长至 10~21 天［20，22-24］。

有证据表明，在小胶质细胞/巨噬细胞/粒细胞内特异性敲减GRK2（LysM-GRK2+/-小鼠）能够延长角叉菜胶引起的痛觉过敏至3 周，但是在伤害性感觉神经元特异性敲减GRK2（SNS-GRK2+/-小鼠）仅延长角叉菜胶引起的痛觉过敏至8 天左右［11］。以上结果提示不同神经细胞中的GRK2 参与炎症痛的机制可能不同。下面将分别讨论神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的GRK2 在炎症痛中的作用（图2）。

图2 GRK2 参与炎症痛的机制Fig 2 The mechanism of GRK2 involved in inflammatory pain

神经元GRK2 在炎症痛中的作用 研究发现，在足底注射角叉菜胶诱导的炎症痛模型中，与对照组相比，小直径初级感觉神经元内GRK2 水平降低约35%［22］。特异性敲减Nav1.8+外周感觉神经元的GRK2（SNS-GRK2+/-小鼠），角叉菜胶引起的热痛觉过敏可以延长至8 天，而野生型（wild type，WT）小鼠的热痛觉过敏仅持续2~4 天左右［23］。在SNSGRK2+/-小鼠中，EPI 诱导的机械痛和热痛觉过敏可延长至21 天左右，而在WT 小鼠中仅持续3~4天［24］。上述结果提示，初级感觉神经元GRK2 水平降低可能是急性炎症痛慢性化的核心机制之一。

研究表明，炎症痛时背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）神经元 GRK2 水平降低可以增强Epac1-to-Rap1信号通路的活性，使cAMP信号传递到Epac1/Rap1。在弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant，FCA）诱导的小鼠炎症痛模型中，CFA 注射5 天后IB4+DRG 神经元内GRK2 水平明显降低，而DRG 内环磷酸腺苷直接激活的交换蛋白1（exchange protein directly activated by cAMP 1，Epac1）水平升高。与对照组相比，足底注射HSVGRK2 使得 DRG 神经元内过表达 GRK2 后 CFA 组小鼠炎症痛明显减轻；鞘内注射Epac1 反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）下 调Epac1 也可以减轻 CFA 诱导的炎症痛［25］。其他研究［26］也显示，CFA 诱导的炎症痛小鼠脊髓内 GRK2降低，GRK2/Epac1 比值降低，脊髓神经元内提高GRK2 表达可显著减轻CFA 诱导的炎症痛。GRK2可以结合Epac1，通过磷酸化Epac1 的Ser-108 位点抑制Epac1 向质膜的易位，从而减少Ras 样小GTP酶 1（Ras-like GTPases 1，Rap1）的激活；小鼠发生炎症痛时 DRG 内 GRK2 降低，Epac1 靶向 Rap1 的活动增加。因此，GRK2 在炎症痛中的作用与Epac1 紧密相关。Epac1 下游的蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）和 MEK/ERK 依赖的信号通路在急性炎症痛转为慢性中发挥重要作用。在EPI/PGE2 诱导的小鼠炎症痛模型中，足底注射蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）抑制剂 H-89 明显减少 WT 小鼠的炎症痛，对 SNS-GRK2+/-小鼠无影响；PKCε 抑制剂TAT-PKCεv1-2明显减少 SNS-GRK2+/-小鼠的炎症痛，对 WT 小鼠无影响；MEK 抑制剂 U0126 可以部分缓解WT 小鼠的急性期炎症痛，明显减少SNSGRK2+/-小鼠的炎症痛［22，24］。由此推断，感觉神经元GRK2 表达降低可将EPI/PGE2 诱导的信号从PKA转向PKCε 和MEK/ERK 依赖的信号通路，从而使急性炎症痛转为慢性［22，24］。有研究表明，P2X3 作为PKCε 下游在炎症痛时表达水平升高，P2X3 受体敏化导致ATP 电流产生增加，参与炎症痛的调节［27］。另外，Epac1 激活也可以增加机械敏感通道Piezo2介导的机械敏感电流，鞘内注射Piezo2 ASODN 下调DRG 内Piezo2 水平可以抑制CFA 诱导的机械性痛觉过敏，而过表达GRK2 可以抑制Epac1 介导的Piezo2 敏化［26］，从而抑制炎症痛转为慢性。

此外，体外研究表明，神经元GRK2 减少可以增强 CCL3 诱导的 TRPV1 敏化，过表达 GRK2 则相反；在GRK2+/-鼠体内瞬时受体电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）参与介导CCL3 诱导的急性炎症痛，足底注射TRPV1拮抗剂预处理可以完全预防CCL3 诱导的急性炎症痛［23］。

小胶质细胞GRK2 在炎症痛中的作用 已有许多证据表明，小胶质细胞在急性痛转为慢性痛中起重要作用［28-29］。例如在大鼠神经病理性疼痛模型中，损伤同侧脊髓小胶质细胞激活，鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素可以预防慢性痛［30］。近年来的研究显示，与对照组相比，小鼠足底注射高剂量角叉菜胶（2%，20 μL）后脊髓小胶质细胞/巨噬细胞 GRK2 减 少约 40%［20］。在 LysM-GRK2+/-（小胶质细胞/巨噬细胞内特异性敲减GRK2）小鼠中，足底注射小剂量角叉菜胶（1%，5 μL）诱导的热痛觉过敏持续至少20 天，而在野生型鼠中2~4 天内就可消退［23］；在角叉菜胶、CCL3、IL-1β 诱导的小鼠炎症痛模型中，GRK2+/-小鼠和LysM-GRK2+/-小鼠炎症痛持续时间基本相同，提示小胶质细胞/巨噬细胞GRK2 在调节这些类型炎症痛的持续时间上可能起决定作用［23］。与野生型小鼠相比，GRK2+/-小鼠足底注射角叉菜胶后第2 天引起的腰髓小胶质细胞/巨噬细胞激活更为显著［23］。鞘内注射小胶质/巨噬细胞抑制剂米诺环素进行预处理，虽然并不影响野生型小鼠和GRK2+/-小鼠足底注射角叉菜胶引起的急性炎症痛（<12 h），但可以显著抑制GRK2+/-小鼠足底注射角叉菜胶形成的慢性痛觉过敏；而在角叉菜胶注射后第7 天鞘内注射米诺环素可以显著缓解GRK2+/-小鼠的热痛觉过敏［23］。以上结果均表明，脊髓内小胶质细胞/巨噬细胞GRK2 的减少，参与了角叉菜胶引起炎症痛由急性期到慢性期的转变。

进一步研究表明，小胶质细胞/巨噬细胞GRK2可 能 通 过 CX3CR1、p38 以及 IL-1β 信 号 参 与 维 持IL-1β 引起的痛觉过敏和小胶质细胞/巨噬细胞的激活［20］。GRK2+/-小鼠足底注射 IL-1β 后第 2 天，腰髓CX3C 趋 化 因 子 受 体 1（chemokine CX3C motif receptor 1，CX3CR1）和 IL-1β mRNA 水平升高，鞘内注射抗CX3CR1 中和抗体或IL-1 拮抗剂IL-1ra可以缓解慢性痛［20］。小胶质细胞CX3CR1 激活后可以激活p38 并导致促炎性细胞因子如IL-1β 产生增多。体外实验证据表明GRK2 可以直接与p38 结合并使p38 的Thr-123 位点磷酸化，从而阻止上游激酶以及下游靶点的结合［31］。IL-1β 注射后第 2 天，鞘内注射p38 抑制剂SB239063 可以逆转LysMGRK2+/-小鼠的热痛觉过敏［20］。

研究表明，GRK2 对于炎症痛的调节与小胶质细胞极化分型有关。在LysM-GRK2+/-小鼠IL-1β 诱导的炎症痛模型中，急性到慢性炎症痛的转变与脊髓中M1 促炎型小胶质细胞/巨噬细胞持续性活化相关［32］。与 WT 小鼠相比，LysM-GRK2+/-小鼠足底注射IL-1β 后，脊髓小胶质细胞/巨噬细胞促炎细胞因子 IL-1β、TNF-α 显著增多、抗炎细胞因子 IL-10显著减少［32-33］。而进一步的研究表明，小胶质细胞的极化分型受到miR-124 的调节。与WT 小鼠相比，足底注射 IL-1β 后 24 h，LysM-GRK2+/-小鼠腰髓小胶质细胞miR-124 表达水平显著降低，鞘内注射miR-124 可以使M1 和M2 标志物表达恢复正常，并抑制IL-1β 诱导的持续性痛觉过敏。此外鞘内注射miR-124 也可以逆转高剂量角叉菜胶诱导的慢性痛［33］。

星形胶质细胞GRK2 在炎症痛中的作用 作为神经系统数量最多的一类细胞，近年来星形胶质细胞在疼痛中的作用被大量报道。研究发现，与野生型对照小鼠相比，尽管GFAP-GRK2+/-小鼠星形胶质细胞内 GRK2 水平降低约 60%［23］，然而星形胶质细胞GRK2 的改变并不影响足底注射IL-1β、角叉菜胶、CCL3 诱导的热痛觉过敏［20，23］。并且，和对照组相比，GFAP-GRK2+/-小鼠中EPI 诱导的机械性痛觉过敏也没有显著差异［24］。星形胶质细胞中GRK2 是否参与其他疼痛模型还有待进一步研究。

GRK2 与镇痛已有研究表明，过表达GRK2可以防止PGE2 诱导的小鼠炎症痛的延长［25］。Epac特异性抑制剂ESI-09 可以抑制CFA 诱导的机械性痛觉过敏而不影响正常痛阈［26］。在持续的炎症痛期间，增加GRK2 或减少Epac1 可以抑制CFA 诱导的慢性痛觉过敏，提示靶向GRK2/Epac1 使GRK2/Epac1 保持稳态可以预防或治疗慢性痛［25］。我们前期的研究也表明，在CFA 诱导的小鼠炎症痛模型中，电针能够通过提高脊髓背角GRK2/Epac1 的比例，使脊髓背角miR-124 表达上调，抑制M1 型小胶质细胞的活化，促进M2 型小胶质细胞的活化，从而缓解炎症痛；降低GRK2 表达可以抑制电针的镇痛以及对miR-124 和小胶质细胞的正向调节作用［34］。

除炎症痛模型外，也有研究表明，在癌痛模型和神经病理性疼痛模型中脊髓GRK2 表达水平降低［12，35-36］。 鞘 内 或 腹 腔 注 射 大 麻 素 2 受 体 激 动 剂JWH-015 可恢复脊髓GRK2 表达水平，并减轻Walker 256 乳腺癌细胞接种诱导的大鼠胫骨癌痛［35］。鞘内注射特异性抑制剂下调miR-15a 和miR-16 可显著增加CCI 大鼠脊髓GRK2 的表达，明显减轻CCI 大鼠的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏［36］。以上研究结果均提示升高脊髓GRK2 可能可以缓解癌痛和CCI 神经病理性疼痛，GRK2 可以成为疼痛治疗的一个潜在新靶点。然而，目前能够恢复脊髓GRK2 的治疗方法只有如大麻素受体激动剂［35］、miR 拮抗剂［36］、针刺疗法［34］等少量报道，更多的治疗药物或方法仍有待进一步研究开发。此外，也有研究显示GRK2 参与神经元阿片受体的脱敏过程［37-38］。在生理状态下，GRK2 可能长期与 δ 阿片受体结合，下调外周感觉神经元δ 阿片受体的抗伤害感受性，导致正常状态下外周δ 阿片受体功能不全。敲低 GRK2 使 δ 阿片受体激动剂 DPDPE 对 δ 阿片受体的激活作用增强，恢复δ 阿片受体的抗伤害感受性［38］。但在疼痛状态下过表达GRK2 是否影响阿片受体激动剂的镇痛效果仍需要进一步研究。

结语目前对GRK2 在炎症痛中的基础和临床研究仍然较少，且基础研究多集中在外周感觉神经元和小胶质细胞中，而针对中枢神经系统神经元和星形胶质细胞中GRK2 的研究相对较少。此外，现阶段的研究表明GRK2 主要在急性炎症痛转变为慢性炎症痛中发挥作用，但相关机制的研究仍然较少，有待进一步探索。有关GRK2 的研究可为炎症痛发病机制的分析和相关新药的研发提供新思路。随着炎症痛机制研究的不断深入，必然为炎症痛的治疗提供新的靶点，进而开发更多、更有效的药物，提高炎症痛患者的生活质量。

作者贡献声明李晓晨 综述构思及撰写，图表绘制。陈愈，王彦青 综述修订。毛应启梁 综述构思及修订。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。