核桃壳固定化微生物降解苯酚研究

刘 羽，王申能，罗瑭秋琦，管 鑫，宗 飞

(延安大学 石油工程与环境工程学院，陕西 延安 716000)

苯酚及其衍生物存在于各种化工行业产生的工业废水中，作为一类原生质毒物，排放到环境中严重影响生态环境及人类的健康，因此，如何有效地处理含酚废水，已成为环境污染领域重点关注的问题之一[1-2]。

酚类物质的去除可以采用物理、化学和生物方法。生物处理方法以其处理彻底、无二次污染等优势被广泛研究和应用[3]。微生物固定化技术是指通过物理或化学的手段将游离的微生物吸附或包埋限定在一定的空间区域，保持其生物活性并能反复利用的方法[4-5]。被固定的细菌活性高、耐毒害能力强、降解污染物的效率高于游离状态下的细菌，且固定化后可实现微生物快速高效分离，近年来被广泛应用于含有机物废水处理，并取得一定的效果，具有良好的应用前景[6-7]。微生物固定化方法有包埋法、交联法、吸附法、共价结合法等[8]。以吸附法来固定化微生物，相比于包埋法和交联法操作更简单，效果也比较明显。曹晓李等[9]人利用改性木屑固定化微球菌，研究了pH、温度和振荡速率对其降酚性能的影响。结果表明，木屑固定化细胞优于游离细胞对环境的耐受能力和降酚速率。

我国核桃产量巨大，废弃的核桃壳如能进行处理和回收利用，既能实现废弃物的资源化，又能利用现有的绿色资源，降低废水处理成本，增加了废弃物循环利用带来的产业效益[10]。实验采用生物质核桃壳吸附固定微生物降解苯酚，考察按不同梯度投加固定化微生物对苯酚降解的影响及重复利用情况，通过研究生物质为载体固定苯酚降解菌，以期为解决治理环境中酚类物质的污染问题提供借鉴。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

本实验使用的高效苯酚降解菌为实验室保存的无色杆菌LQ-1(Achromobactersp.)，具有较好的苯酚降解性能。市售核桃壳，通过粉碎后人工筛选得到不同粒径的固定化材料，如图1所示。

图1 不同粒径核桃壳

蛋白胨、酵母浸粉和琼脂粉(北京奥博星生物技术有限公司)。氯化钠、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、氯化铵(NH4Cl)、氯化钙(CaCl2)、苯酚、氨水、铁氰化钾、4-氨基安替比林、氢氧化钠、无水乙醇和盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UVmini-1240紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；LS-30立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯公司)；HR/T20M高速冷冻离心机(湖南赫西公司)；BCM-1300A生物洁净工作台(苏净公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃壳的预处理

市售核桃壳用蒸馏水洗净，在100℃干燥8 h，取出后利用粉碎机将核桃壳粉碎至10 mm左右的块状，核桃壳碎屑弃用，将剩余的核桃壳块按要求粒径过筛并存于自封袋内备用。

1.3.2 培养基的制备

LB富集培养基：分别称取5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、5 g氯化钠溶于500 mL蒸馏水中，调节pH为7.0 ± 0.2，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，冷却后用于细菌富集。

无机盐培养基：分别称取Na2HPO44.26 g、KH2PO42.65 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.02 g、NH4Cl 0.1 g，1 mL的微量元素[11]投加至1000 mL蒸馏水中，调节pH至7.0 ± 0.2，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，冷却后用于细菌培养。

1.3.3 核桃壳载体吸附苯酚实验

配制所需浓度的苯酚溶液，称取0.1～0.9 g核桃壳分别投加到苯酚溶液中，摇床温度为37 ℃，转速为160 r/min进行吸附实验，5 h内取样测定苯酚浓度。

1.3.4 固定化微生物的制备

1.重新构建了会计核算模式。政府新会计制度构建了“财务会计和预算会计适度分离并相互衔接”的会计核算模式。分离了财务会计和预算会计功能、财务报告和决算报告功能，让政府会计主体的财务信息和预算执行信息得到更加全面的反馈。主要体现在“双功能、双基础、双报告”上。“双功能”是指按照政府新会计制度改革以后，事业单位会计核算同时具有权责发生制和收付实现制的两大功能；“双基础”是指财务会计按资产、负债、净资产、收入与费用五大会计要素进行核算，而预算会计按预算收入、预算支出与预算结余三大会计要素进行核算；“双报告”是指财务会计编制的财务报告和预算会计编制的决算报告。

分别称取一定质量预处理好的核桃壳投加至LB培养基中，灭菌冷却后，将无色杆菌LQ-1接种到LB培养基中，恒温培养30 h左右(摇床温度为37 ℃，转速为160 r/min)[12]，LB培养基明显变得浑浊，核桃壳载体上形成吸附固定化生物膜，用镊子取出，用蒸馏水轻轻冲洗2～3次，去除核桃壳表面的游离细胞，得到核桃壳固定化微生物。

固定化微生物的细菌负载量测定如下：利用超声波清洗器将负载到材料上的无色杆菌震荡至无机盐培养基中，测定OD600进行换算，得到菌体的负载量。

1.3.5 固定化微生物降解苯酚实验

250 mL的锥形瓶中加入灭菌的无机盐溶液100 mL，配制好浓度约为300 mg/L的苯酚溶液。初始的游离菌浓度OD600为0.2～0.3，固定化微生物按固定质量投加，苯酚浓度变化实验，固定化微生物投加量为0.5 g，苯酚浓度范围为100～800 mg/L，恒温摇床培养，每间隔2 h取样测定苯酚浓度。

1.3.6 固定化微生物降解苯酚重复性实验

当苯酚溶液吸光度快接近于零时，取出其中的核桃壳固定化微生物，轻轻冲洗表面的游离细菌，再放至重新配制好的300 mg/L的苯酚的溶液中，重复下次实验，每隔一定时间取样测定溶液的OD600和苯酚浓度。

1.4 数据分析方法

1.4.1 苯酚浓度的测定

1.4.2 细菌质量浓度的测定

在600 nm下，采用紫外分光光度计测量出菌密度数值的大小OD600，并用称重法测定对应OD600与质量浓度的换算关系，计算出细菌的质量[14]。细菌吸光度值OD600与细菌质量浓度的关系式：

y=0.3108x+0.0033

式中：y为细菌的质量浓度(mg/mL或g/L)；x为细菌吸光度值即OD600

2 结果与讨论

2.1 游离菌降解苯酚性能

无色杆菌LQ-1降解苯酚的能力如图2所示，反应体系初始OD600为0.246，细胞浓度为0.080 mg/mL。在0～15 h细菌降解苯酚速率较缓慢，苯酚浓度从309.92 mg/L降至205.86 mg/L，去除率为33.57%。15 h后细菌降解苯酚速率增加，20 h 后苯酚浓度降至33.04 mg/L，去除率为89.34%，在28 h时达到98%以上。同时，随着时间的增加，开始时苯酚有抑制作用，菌量降低，9 h后，微生物适应了苯酚环境，利用苯酚作为底物，自身不断生长增殖，细菌浓度逐渐增加，在25 h达到饱和状态，细胞浓度达到0.192 mg/mL。

图2 无色杆菌LQ-1降解苯酚曲线

2.2 固定化载体对细菌的负载能力研究

取不同粒径的核桃壳各0.5 g，考察不同粒径核桃壳对细菌负载量的影响，如图3所示，核桃壳粒径越小，细菌负载的效果越好，0.5 g核桃壳(1～2 mm)的细菌负载量为2.173 mg，同样质量下3～5 mm核桃壳的细菌负载量为1.632 mg。虽然1～2 mm的核桃壳比表面积最大，效果最好，但由于其粒径较小，易流失，因此后续实验选择粒径为3～5 mm的核桃壳作为细菌吸附载体。

图3 不同粒径核桃壳载体对菌的负载效果

粒径为3～5 mm的核桃壳投加量对细菌负载量的影响如图4所示，核桃壳投加量为0.1 g时，细菌负载量为0.453 mg，当核桃壳投加量增长至0.9 g时，细菌负载量为2.671 mg，增长了近6倍。细菌负载量随核桃壳载体投加量的增加而增加，相关系数接近于1，线性关系良好，负载能力稳定。

图4 不同投加量核桃壳载体对菌的负载效果

固定化微生物技术可降低功能微生物受外界不利因素的影响程度，微生物活性强、密度高。

吸附法主要利用材料孔隙、表面官能团、静电作用力等实现微生物固定[15]，不同性质载体表面差异会造成胞外聚合物(EPS)等微生物分泌物性质上的差异，从而导致附着和负载情况不同[16]。核桃壳作为植物载体，有天然环保的优点，成本低，直接用来作为微生物固定化载体，不会带来二次污染，负载细菌能力稳定，同时达到了以废治废的目的[17]。

2.3 核桃壳载体吸附苯酚能力研究

不同投加量核桃壳对苯酚的吸附曲线如图5A所示，由图可知，在苯酚浓度为300 mg/L的情况下，随着核桃壳投加量的增多，苯酚吸附量发生变化，5 h基本达到吸附饱和，平衡吸附量随着核桃壳质量的增多而减小，投加0.1、0.5和0.9 g核桃壳时苯酚的平衡吸附量分别为19.936、8.134、4.563 mg/g，说明投加更高浓度的核桃壳并不能实际增大其吸附苯酚的能力，按照去除率统计投加0.7 g核桃壳时苯酚去除率最大为13.84%。不同苯酚浓度的吸附曲线如图5B所示，小于100 mg/L的苯酚5 h后的去除率可以达到85%以上，随着本底浓度的增高，平衡吸附量相对稳定在16 mg/g以下，去除率有所降低，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃壳，平衡吸附量为8.916 mg/g，去除率为13.99%。实验结果表明，核桃壳具有一定的吸附能力，但效果一般，天然核桃壳本身空隙结构不规则，其表面电荷性质与苯酚产生吸附的匹配度较低[18]。

图5 核桃壳投加量(A)及苯酚起始浓度(B)对吸附效果的影响

2.4 固定化微生物苯酚降解性能研究

游离菌及固定化细菌降解苯酚过程如图6所示，游离细菌的投加量控制OD600为0.2～0.3，实际菌浓度约为0.080 mg/mL，8 h后开始有效降解苯酚，25 h左右降解完全。对于固定化微生物，其降解苯酚能力显著提高，整体而言，在12 h之前，核桃壳固定化微生物降解苯酚较缓慢，与游离微生物修复效果差异不大，这是因为微生物在初期主要是在合成自身物质，处于生长阶段，苯酚浓度的降低主要由吸附所致，12 h后速度明显提高，0.5 g的固定化细菌，20 h的去除率即可达到98.40%，对于0.9 g的固定化细菌，16 h去除率即可达到95.47%。在此过程中，核桃壳吸附及微生物降解具有协同作用，此外，天然核桃壳本身分解产物可能为苯酚降解微生物提供了共代谢底物，促进了菌量的增加，强化了苯酚处理效果。

图6 游离菌与固定化微生物降解苯酚曲线

考察固定化微生物对不同浓度苯酚降解效果，如图7所示，投加0.5 g的固定化菌，随着苯酚底物浓度的增大，苯酚降解时间延长，最终可以耐受700 mg/L的苯酚浓度，36、40 h去除率分别达到94.63%和97.83%，但当苯酚浓度提升到800 mg/L时，浓度过高可能对固化微生物产生毒害作用，使得生物降解停滞。

图7 固定化微生物降解苯酚不同浓度苯酚曲线

实验中对游离细胞进行了降解苯酚浓度适应性研究，游离细胞能耐受的苯酚浓度为500 mg/L，固定化细菌明显提高，这是因为固定化细菌与载体的多位点结合使其内部结构更加稳定，降低了苯酚毒性对细菌分子结构及酶系的影响和破坏[19-20]。王蕾等[21]利用PUF固定化菌株降解苯酚，经过120 h 对1 000 mg /L 苯酚的降解率达到72.96%，虽然其可以耐受更高浓度的苯酚，但反应周期过长，降解率也偏低。

2.5 核桃壳固定化微生物的重复利用性研究

核桃壳固定化微生物的重复利用性研究如图8所示，在第1次使用时，23 h的苯酚降解率达99.33%。重复使用6次，苯酚去除率保持99%以上，降解时间大大降低，去除300 mg/L的苯酚由原来的23 h缩短至14 h，此过程细菌会在核桃壳表面形成一层生物膜，对外部的适应性逐渐增强，初始的负载菌量也随之增加，降解苯酚效率提高。重复使用7次后苯酚的去除率开始逐渐降低，菌量也随之降低，其主要原因是多次的重复使用导致核桃壳表面的附着菌体能力降低，传质阻力提高，生物膜脱落，菌体流失及老化[22]。

图8 核桃壳固定化微生物的重复利用

3 结论

(1)无色杆菌LQ-1降解苯酚，反应体系初始细胞浓度为0.080 mg/mL ，28 h去除率达到98%以上，细胞浓度增长至0.192 mg/mL。

(2)粒径为3～5 mm的核桃壳作为细菌吸附载体性能稳定，0.5 g核桃壳的细菌负载量为1.632 mg；核桃壳具有一定的苯酚吸附能力，但效果一般，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃壳，平衡吸附量为8.916 mg/g，去除率为13.99%。

(3)固定化微生物降解苯酚能力显著提高，投加0.5 g的固定化细胞，20 h的去除率即可达到98.40%，核桃壳吸附及微生物降解协同作用强化了苯酚处理效果。

(4)固定化细菌可耐受700 mg/L的苯酚浓度，优于游离细菌，40 h去除率达到97.83%。核桃壳固定化微生物重复使用6次，苯酚去除率保持99%以上，去除300 mg/L的苯酚由原来的23 h缩短至14 h。