基于TGF-β1/Smads通路的鹿红方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

杨晓利，瞿惠燕，戎靖枫，杨天舒，兰真真，周华，

1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；3.上海市中西医结合心血管病研究所，上海 201203

心力衰竭是一种由于心室收缩或舒张功能受限，导致心室不能正常射血而引起心脏组织灌注不足、静脉系统淤血等表现的循环障碍疾病[1]，是各种心脏疾病最终阶段。我国约有450 万心力衰竭患者，并以每年50 万人速度增长[2]。如何有效防治慢性心力衰竭已成为目前心血管疾病亟需攻克的难题。研究表明，心力衰竭的发病原因以心肌梗死最为常见，其关键病理机制为心室重构[3]，而心室重构的基础病理变化是心肌纤维化[4]。故寻找防治心肌纤维化，延缓心室重构，减少心肌梗死后心力衰竭的药物尤为重要。研究表明，转化生长因子-β1（TGF-β1）是促进胶原和纤维连接蛋白合成与沉积的关键因子，可刺激下游Smads蛋白在心肌纤维化中发挥重要作用[5-7]。尽管西医治疗可在一定程度上改善心肌纤维化，降低心力衰竭的发病率和死亡率，但长期使用存在耐药性及不良反应。中医药治疗具有多环节、多靶点干预的优势，可有效改善慢性心力衰竭。鹿红方是周华教授依据“心肾相关”理论及多年临床经验研制的院内制剂，具有温补心肾、活血通络功效，与目前临床常见的阳虚血瘀型心力衰竭契合。课题组前期临床及基础研究显示，鹿红方能显著改善心功能、抑制心脏间质重构、延缓心力衰竭的发展[8-11]。本研究以心肌梗死后心力衰竭大鼠为模型，基于TGF-β1/Smads 通路探讨鹿红方对心肌纤维化的影响，进一步明确其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级Wistar 雄性大鼠60 只，体质量（213±27）g，8 周龄，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK（沪）2017-0014，动物实验伦理号SZY201807001。饲养于上海中医药大学实验动物中心，温度（25±1）℃、湿度30%摄食，自由饮水，光照周期12 h，适应性饲养1 周后进行实验。

1.2 药物

鹿红方（鹿角片15 g，红花9 g，补骨脂20 g，淫羊藿30 g，女贞子30 g，山萸肉15 g，沉香6 g），饮片均为颗粒剂，江阴天江药业有限公司提供；培哚普利片，8 mg/片，施维雅（天津）制药有限公司，批号190527-02。

1.3 主要试剂与仪器

TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 引物，上海擎熙生物科技有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox），瑞士Roche 公司，货号04913 914001；HyPureTMMolecular Biology Grade Water，美国HyClone 公司，货号SH30538.02；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美国Thermo 公司，货号#K1622。Masson 组织芯片扫描仪，匈牙利3DHISTECH 公司，型号Pannoramic 250；小型动物呼吸机，江西特力公司，型号TIC-200A；彩色多普勒超声，美国GE 公司，型号Voluson i；显微镜，日本Olympus，型号4kx41；荧光定量PCR 仪，美国ABI 公司，型号7300。

1.4 造模

大鼠适应性喂养1 周，术前12 h 禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠（3 mL/kg）麻醉，固定于手术板上，剪去胸部毛发，连接心电图机，记录术前心电图。持气管插管向下轻轻按压大鼠舌根部，充分暴露会厌区，待气管开放迅速插入气管插管，连接呼吸机，见胸廓起伏与呼吸机频率一致为插管成功。消毒心前区，于左侧胸部第4～5 肋间心脏搏动最强处剪开长约1 cm 皮肤，剥离横纹肌和竖纹肌，撑开肋间肌，充分暴露心脏，撕开心包膜，找到左心耳，在距左心耳根部1 mm 处结扎左冠状动脉前降支，结扎处心肌颜色由红转白、心脏跳动节律逐渐减弱、心电图Ⅱ导联显示ST 段呈现弓背向上抬高，表明心肌梗死模型制备成功[12-13]。立即将心脏回位，止血后缝合肌肉、皮肤，大鼠恢复自主呼吸后撤掉呼吸机，右侧卧位于恒温垫上至大鼠苏醒，予以水和食物并密切观察术后情况。术后14 d 行超声心动图检查，左室射血分数（LVEF）≤50%表明心肌梗死后心力衰竭模型制备完成[14]。假手术组只缝合不结扎。

1.5 分组及给药

大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组和鹿红方低、中、高剂量组，每组10 只。成模后灌胃给药，给药剂量参照成人每日常用剂量进行换算[15]，鹿红方低剂量组0.625 g/kg、中剂量组1.25 g/kg、高剂量组2.5 g/kg，培哚普利组2 mg/kg，假手术组和模型组予等体积生理盐水。给药体积1 mL/kg，每日1 次，连续8 周。

1.6 心脏功能观察

药物干预8 周后，称量大鼠体质量，1%戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，彩色多普勒超声检测各组大鼠LVEF 及缩短分数（FS）。

1.7 病理观察

大鼠麻醉后开胸，剪断主动脉，取出心脏，PBS冲洗，切除部分心脏组织放入多聚甲醛溶液中，经脱水、包埋、切片等程序后进行HE 和Masson 染色。基于Masson 染色结果，使用Image Pro Plus 6.0 计算心肌胶原容积分数（CVF），即心肌胶原面积占全视野面积的百分比。

1.8 转化生长因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达检测

取大鼠心肌组织，Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA 浓度，反转录试剂盒获得cDNA，按PCR 试剂盒说明书进行反应：95 ℃预变性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，循环40 次，75～95 ℃每20 s 升温1 ℃，绘制融解曲线。以GAPDH 为内参，运用PCR 仪分析实验结果，得到样品的Ct 值，并计算ΔCt，采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.9 转化生长因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表达检测

取100 mg 心肌组织，剪碎后加入1 mL RIPA 裂解液（含10 μL PMSF），冰上匀浆10 s×3 次，静置30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度；上样，电泳（75 V、20 min，120 V、20 min），200 mA 转膜1 h，5%脱脂牛奶封闭1 h；滴加TGF-β1 一抗（1∶200）、Smad2 一抗（1∶400）、Smad3 一抗（1∶400）和Smad7 一抗（1∶400），4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜5 min×3 次，加入二抗（1∶3 000）室温孵育30 min，TBST 洗膜5 min×3 次；ECL 发光液显影，凝胶成像系统成像，以GAPDH 为内参，使用Alpha3.2.0.8 分析目的蛋白条带灰度值。

1.10 统计学方法

采用SPSS25.0 统计软件进行分析。计量资料以表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

假手术组大鼠未出现死亡情况，模型组大鼠因水肿较重死亡4 只，培哚普利组死亡2 只，鹿红方低剂量组死亡2 只，鹿红方中、高剂量组各死亡1 只。模型组大鼠术后食欲明显减退，毛发缺乏光泽，活跃度明显降低，体质量明显减轻，各给药组大鼠上述情况较模型组均有所改善。

2.2 鹿红方对模型大鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、FS 明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，鹿红方低、中、高剂量组及培哚普利组大鼠LVEF、FS 明显升高（P＜0.01）；与培哚普利组比较，鹿红方中、高剂量组大鼠LVEF、FS 明显升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠LVEF、FS 比较（，%）

表2 各组大鼠LVEF、FS 比较（，%）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与培哚 普利组比较，▲P＜0.05

2.3 病理观察结果

HE 染色显示，假手术组心肌细胞排列较紧密，分界轮廓较清晰，未见细胞坏死，间质内有少量肥大细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱无序，局部出现心肌细胞消失，被大量增生的结缔组织替代，心肌细胞明显水肿甚至坏死，结缔组织内存在大量淋巴细胞浸润，局部可见较多肥大细胞；鹿红方低、中、高剂量组及培哚普利组大鼠结缔组织增生相对减少，可见少量淋巴细胞浸润，心肌细胞水肿、坏死及纤维化程度均有不同程度减轻。结果见图1。

图1 各组大鼠心脏组织形态（HE 染色，×100）

Masson 染色显示，模型组大鼠心脏组织出现大量胶原纤维沉积，心肌纤维化病变比较明显，局部有大量肌纤维断裂、萎缩变性，梗死区域附近存在大量炎性细胞浸润；鹿红方低、中、高剂量组及培哚普利组大鼠心脏组织胶原纤维沉积减少，炎性细胞浸润减轻，局部肌纤维断裂和萎缩变性程度均有所改善。结果见图2。

图2 各组大鼠心脏组织形态（Masson 染色，×20）

与假手术组比较，模型组大鼠CVF 升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，鹿红方低、中、高剂量组及培哚普利组大鼠CVF 显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠CVF 比较（，%）

表3 各组大鼠CVF 比较（，%）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.4 鹿红方对模型大鼠转化生长因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表达显著升高，Smad7 mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，鹿红方中、高剂量组及培哚普利组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表达明显降低，Smad7 mRNA 表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），鹿红方低剂量组大鼠心肌组织Smad2、Smad3 mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表4。

表4 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表达比较（）

表4 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 表达比较（）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

2.5 鹿红方对模型大鼠转化生长因子-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表达明显升高（P＜0.01），Smad7蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，鹿红方低、中、高剂量组及培哚普利组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2 蛋白表达明显降低，Smad7 蛋白表达明显升高（P＜0.01），鹿红方中、高剂量组及培哚普利组大鼠心肌组织Smad3 蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结果见表5、图3。

表5 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表达比较（）

表5 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白表达比较（）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

图3 各组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 蛋白免疫印迹图

3 讨论

心肌损伤后，心肌组织纤维化改变导致的心室重构是心力衰竭的主要病理机制[16-17]，亦是构成心力衰竭患者预后不佳的主要因素。研究显示，TGF-β1/ Smads 信号通路是引起心肌纤维化的经典途径，其中TGF-β1 是心肌纤维化引起心室重构的关键调控因子，具有强促纤维化作用，可促进成纤维细胞的胶原增生与合成及纤维连接蛋白的沉积[18]。TGF-β1 通过激活Smads 蛋白促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，引起细胞外基质大量沉积，导致心肌纤维化，诱发心力衰竭[19-21]。研究表明，以Smad2、Smad3 为代表的受体调节蛋白被磷酸化后，可与Smad4 通用蛋白结合[22]，TGF-β1 可刺激进入细胞核的Smad4，激活纤维化相关基因转录，增强心肌纤维化。Smad7 能使Smad2、Smad3 的磷酸化受到抑制，发挥抗纤维化作用，TGF-β1 可通过抑制Smad7 激活Smad2 和Smad3而起到负调节效应[23]。因此，基于TGF-β1/ Smads 信号通路寻求防治心肌纤维化的策略为心力衰竭治疗提供了新方向。

心力衰竭属中医学“心痹”“水肿”等范畴，其基本病因可概括为心气虚，以虚、瘀、水为特点。鹿红方方中鹿角片温肾益精、行血消肿，红花活血祛瘀止痛，二者同用达到通利心脉、温阳活血效果，共为君药；补骨脂补肾助阳、纳气平喘，淫羊藿温肾壮阳、强筋健骨，二者联用增强鹿角温补肾阳的作用，共为臣药；山萸肉补益肝肾、收敛固涩，女贞子补益肝肾、清除虚热，沉香温肾降逆、纳气平喘，三者共为佐药。全方以补虚为本，兼顾瘀血，滋阴补阳，重在补阳，达到阴中求阳的目的。心肾相交，心本乎肾，从而达到温肾强心的作用。以上药物相互配合使用，与心肾两脏阳气不足，无力行血导致血脉不畅，水饮停滞的病机相对应。临床上鹿红方可改善慢性心力衰竭患者临床症状及心功能，显著改善心肌纤维化[24]。基础实验表明，鹿红方可有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心脏间质重构[25-27]，其中鹿角能增强心肌收缩力，改善冠脉血流和心肌重构，调节心肌能量代谢，进而延缓心力衰竭进程补充文献[28]；红花可抑制心脏重构，延缓脂多糖诱导的心肌纤维化[29]；补骨脂能增强大鼠超氧化物歧化酶活性，使心肌组织中丙二醛含量与体内氧自由基减少，从而抑制慢性心力衰竭心肌损伤[30]；淫羊藿苷可改善心功能，延缓心肌纤维化，逆转心室重构[31]；山萸肉、女贞子中齐墩果酸等成分可增强心肌收缩力，改善心肌纤维化[32]。

本研究发现，鹿红方能提高模型大鼠LVEF 和FS，改善心功能，减少心肌组织炎性细胞浸润、结缔组织增生、心肌纤维化，下调TGF-β1、Smad2 及Smad3 mRNA 和蛋白表达，上调Smad7 mRNA 和蛋白表达，以鹿红方中、高剂量组效果最明显。本实验结果提示，鹿红方对心肌纤维化具有良好的抑制作用，其机制可能与调控TGF-β1/Smads 通路有关，可为中医药防治心肌纤维化研究提供实验依据。