短时间吸入不同浓度七氟醚对幼鼠空间学习记忆能力及海马神经细胞凋亡的影响

萧治恒，吴论，彭学强，赵立梅，刘鉴，梁鸿韬

（中山市中医院，广东 中山528400）

现阶段，麻醉药物神经毒性是国际麻醉界的主要研究热点之一，相关研究指出，相较于其他麻醉药物，七氟醚效果更优越，患者不良反应更少，已在婴幼儿手术麻醉中得到广泛使用[1-4]。亦有报道表明，七氟醚可能提高婴幼儿术后认知异常发生率[5-6]。选择何种浓度七氟醚开展婴幼儿手术麻醉依然有待进一步探讨。本文以80 只SD 幼鼠作为实验对象，探讨短时间吸入不同浓度七氟醚对幼鼠空间学习记忆能力及海马神经细胞凋亡的影响，以期为婴幼儿患者七氟醚的应用提供有效指导。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

选取无特异病原体（specific-pathogen free，SPF）级雄性SD 幼鼠80 只[生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002，使用许可证号：SYXK（粤）2013-00011]，均为1 个月龄，体重100～110 g，平均（105±5）g，均购自广东省医学实验动物中心。选择实验室平衡饲料喂养，使其自由进食、饮水，控制光照与黑暗各12 h，湿度55%～58%，室温22～25℃，确保饲养环境安静。

1.2 试剂与仪器

七氟醚（上海恒瑞医药有限公司），麻醉气体监测仪（美国Datex-Ohmeda 公司），Morris 水迷宫实验装置（上海海软隆科技发展公司），Fluo3-AM 荧光指示剂、Pluronic F-127（日本同仁化学研究所），激光共聚焦显微镜（型号：FV10i，日本奥林巴斯公司），流式细胞分析仪（型号：BD FACSAria，美国Bection Dickinson 公司）。

1.3 方法

1.3.1 幼鼠分组与模型复制实验开始前，所有幼鼠开展4 d 水迷宫学习训练，然后采取随机数字表法将其分为4 组，每组20 只。对照组单纯吸氧2 h，控制氧流量2.0 L/min；在和对照组幼鼠相同吸氧条件下，1%七氟醚组吸入1%七氟醚2 h，2%七氟醚组吸入2%七氟醚2 h，3%七氟醚组吸入3%七氟醚2 h，采用麻醉气体监测仪进行气体浓度监测，并使用挥发罐合理调控七氟醚具体吸入浓度。

1.3.2 Morris 水迷宫实验幼鼠吸入结束后12 h，各组取5 只幼鼠开展Morris 水迷宫实验，让其在水池里自由游泳60 s，详细记录其平台象限停留时间及穿台次数。

1.3.3 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色幼鼠吸入结束后12 h，各组取5 只幼鼠，采用多聚甲醛进行心脏灌注，然后取出全脑制作石蜡切片，HE 染色后详细观察幼鼠海马组织神经元形态学改变情况；每只幼鼠选择10 张切片，并对海马神经元凋亡详细数目进行计数，计算平均值。

1.3.4 细胞凋亡幼鼠吸入结束后12 h，各组取5只幼鼠断头处死，采取无菌手术器械将其大脑取出，于放置磷酸盐缓冲液冰盘上进行双侧海马分离（3 min内完成），然后制备单细胞悬液。采取锥虫蓝进行细胞活力检测，确保活细胞>95%。用2.5 ml 含有血清培养基进行细胞重悬，获得5×105个/ml的细胞浓度。在流式管里面加入100 μl 细胞悬液，再放入5 μl Annexin V 及10 μl 碘化丙啶溶液。置于室温条件下避光反应20 min，并于1 h 内用流式细胞分析仪进行凋亡测定。通过BD FACSDria Softwa 完成结果分析。

1.3.5 钙离子浓度幼鼠吸入结束后12 h，各组取5 只幼鼠，断头取其海马组织，制备单细胞悬液，制备细胞图片，确保细胞贴壁。采取Hank 平衡盐溶液对1 mmol/L Fluo3-AM 母液进行稀释，获得5 μmol/L 工作液。加入该工作液5 μmol/L 及0.05%Pluronic F-127，有效覆盖细胞。持续孵育45 min后用Hank 平衡盐溶液洗涤细胞3 次，有效去除工作液。然后于培养箱里避光孵育10 min。采用75%酒精持续浸泡5 min，使用处理过的盖玻片将其轻轻盖上，防止产生气泡。在激光共聚焦显微镜相应样品小槽里放置上述负载完成后的细胞涂片。控制激发光488 nm 及发射光530 nm。于低倍镜下发现神经元细胞（见图1），再于×40 高倍物镜下完成扫描拍照。通过荧光强度变化间接反映钙离子水平的变化（见图2）。

图1 海马神经元选定图 （×10）

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Morris水迷宫实验结果比较

各组平台象限停留时间、穿台次数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），2%七氟醚组、3%七氟醚组平台象限停留时间较对照组缩短（P<0.05），穿台次数较对照组减少（P<0.05）。见表1。

表1 各组Morris水迷宫实验结果比较 （n=5，±s）

表1 各组Morris水迷宫实验结果比较 （n=5，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与1%七氟醚组比较，P <0.05。

组别对照组1%七氟醚组2%七氟醚组3%七氟醚组F 值P 值平台象限停留时间/s 26.54±2.87 24.07±2.68 12.50±1.49①②12.38±1.46①②56.839 0.000穿台次数1.85±0.21 1.69±0.20 0.75±0.08①②0.67±0.07①②79.637 0.000

2.2 各组HE染色结果比较

对照组、1%七氟醚组、2%七氟醚组及3%七氟醚组的凋亡神经元数目分别为（1.92±0.22）个/视野、（2.14±0.25） 个/视 野、（38.57±4.16） 个/视 野 及（40.35±4.38）个/视野，经方差分析，差异有统计学意义（F=56.839，P=0.000），2%七氟醚组、3%七氟醚组较对照组增加（P<0.05）。见图3。

2.3 各组海马神经元凋亡率比较

各组早期凋亡率、晚期凋亡率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；2%七氟醚组、3%七氟醚组较对照组增加（P<0.05）。见表3。

2.4 各组细胞荧光强度、钙离子浓度比较

各组荧光强度、钙离子浓度比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）；2%七氟醚组、3%七氟醚组荧光强度较对照组增加（P<0.05），钙离子浓度较对照组升高（P<0.05）。见表4。

3 讨论

图2 实时监测荧光强度图

图3 各组海马组织神经元形态学改变 （HE×400）

表3 各组海马神经元凋亡率比较 （n=5，%，±s）

表3 各组海马神经元凋亡率比较 （n=5，%，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与1%七氟醚组比较，P <0.05。

组别对照组1%七氟醚组2%七氟醚组3%七氟醚组F 值P 值早期凋亡率11.23±1.28 12.58±1.30 24.36±3.78①②26.85±3.81①②39.773 0.000晚期凋亡率8.12±0.93 9.26±1.05 17.38±1.87①②19.36±2.14①②63.928 0.000

表4 各组细胞荧光强度、钙离子浓度比较 （n=5，±s）

表4 各组细胞荧光强度、钙离子浓度比较 （n=5，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与1%七氟醚组比较，P <0.05。

组别对照组1%七氟醚组2%七氟醚组3%七氟醚组F 值P 值荧光强度104.36±18.67 108.79±19.98 287.53±35.12①②296.37±36.54①②69.178 0.000钙离子浓度/（nmol/L）79.50±11.28 82.36±11.94 185.37±26.85①②193.58±27.62①②44.936 0.000

有研究指出，幼鼠七氟醚最低肺泡的有效浓度为2.3%左右，吸入大约2.3%～3.5%七氟醚不会对其心血管功能与体内重要器官组织血流灌注产生影响[7-8]。故笔者选择吸入1%、2%与3%浓度的七氟醚开展研究。有报道认为，吸入七氟醚能够影响认知功能，同时雄性幼鼠敏感性较雌性幼鼠更高[9-10]。故本研究全部选择雄性幼鼠作为实验对象。Morris 水迷宫实验能客观评价幼鼠认知功能，具有操作简单、数据误差较小等优点。Morris 水迷宫实验还能够检测实验动物运动功能、学习记忆能力及感觉障碍等，客观反映动物认知功能[11-12]。本研究中2%七氟醚组、3%七氟醚组平台象限停留时间、穿台次数明显少于其余两组，且2%七氟醚组与3%七氟醚组、对照组与1%七氟醚组比较无显著差异，表明短时间吸入高浓度七氟醚可降低幼鼠空间学习记忆能力。HE 染色显示，对照组与1%七氟醚组幼鼠神经元细胞核体积较其他两组大，同时具有规整性，短时间吸入高浓度七氟醚组幼鼠细胞皱缩，并且形态不规整，海马神经元凋亡数明显高于低浓度七氟醚组与对照组，提示高浓度七氟醚能够导致海马神经元产生形态学改变，加快海马神经元凋亡。本研究结果显示，2%七氟醚组、3%七氟醚组海马神经元早期凋亡率及晚期凋亡率明显高于其余两组，与徐桂萍等[13]研究结论相符。说明短时间吸入2%或者3%七氟醚可提高幼鼠海马神经细胞早期与晚期凋亡率。细胞之中钙离子水平升高属于细胞凋亡的重要条件，为进一步明确短时间吸入不同浓度七氟醚是否会对细胞之中钙稳态造成影响，继而导致其凋亡。本实验制备了幼鼠海马神经细胞涂片，并进行钙荧光试剂负载，通过激光共聚焦显微镜了解钙离子变化。若实验培养黏附细胞，则其将牢固黏附于相应培养皿表面或者载玻片表面，而新鲜海马组织获得的单细胞悬液，其神经元贴壁具有一定难度[14]。为有效解决该问题，需要处理载玻片。一般通过聚乙烯醇、多聚赖氨酸或者蛋清等作为相应粘贴剂，实验过程中需结合细胞特性合理选择处理手段[15]。本研究通过多聚赖氨酸进行载玻片，最终海马神经细胞贴壁。考虑各种细胞特性以及活性，确保实验染色成功具有较强技术性[16]。本研究最终确定所用Fluo 3-AM 浓度应该为5 μmol/L，且持续孵育45 min。本研究显示，2%七氟醚组、3%七氟醚组荧光强度、钙离子浓度显著高于1%七氟醚组与对照组，提示高浓度七氟醚导致海马神经细胞凋亡的同时，细胞之中钙离子增加，并由于钙失衡导致神经细胞凋亡。本研究发现，短时间吸入低浓度七氟醚麻醉不会对幼鼠学习记忆能力产生严重影响，不代表幼鼠随时间逐渐延长，不会产生神经行为改变，该观点有待后续研究进一步论证。

综上所述，短时间吸入低浓度七氟醚并不会严重影响幼鼠学习记忆能力，但是短时间吸入高浓度七氟醚能够降低其认知能力，提高海马神经细胞凋亡率，增加细胞之中钙离子浓度，导致触发凋亡。