基于GC/MS结合多元统计学筛选爆珠香精中香味标志物

张 华 刘 琪 叶远青 朱怀远 廖惠云

(江苏中烟工业有限责任公司技术中心，江苏 南京 210019)

爆珠香精又称香丸、脆性胶囊、珠子，是一种由高分子聚合物包裹香精料液而形成的密封脆性胶囊，主要被应用于食品、快速消费品等[1-4]。近年来，因其新颖、独特的加香方式备受消费者喜爱，对加香用爆珠香精的研究亦日益增多[5-7]。爆珠香精主要由内含物芯材和壁材组成，其中芯材是由多种香精香料和适量溶剂调和制成的特色香味液体，壁材通常由明胶、改性淀粉、卡拉胶等滴制成型。壁材达到触发条件时破裂，芯材成分得以释放，实现增香目的。爆珠香精内含物受原料产地、加工工艺等多种因素影响，产品质量存在一定波动，仅从其物理指标和感官方面判断无法从本质上准确客观把握其质量变化[8-9]。

爆珠香精质量稳定性的评价主要受限于直径、胶皮厚度、破碎压力、外观、水分以及环境湿度[10-14]等物理指标，目前有关影响爆珠香精整体香味和内在品质的化学指标的研究较少[15]。何媛等[16]采用GC/MS指纹图谱评价爆珠内含物的质量稳定性；朱玲等[17]基于紫外光谱和支持向量机回归算法，建立单值控制图对爆珠内液的稳定性进行快速判定。以上多是基于内含物成分来判断爆珠香精的质量稳定性，因方法本身局限性，其对数据变化不敏感，难以有效监控爆珠香精质量实际变化情况。在具体成分分析方面，只选择单一特征物质或者选择所有能定性出的物质进行表征分析均欠妥当，前者不能反映整个爆珠香精内在成分含量情况，而后者操作烦琐、效率低下。因此，针对性地筛选合适的特征标志成分显得较为可行。

考虑到爆珠香精具有化学组成成分复杂等特点，而其指纹图谱能够充分提取爆珠香精中的有效化学成分信息，具有整体性和全面性。通过指纹图谱方法能够在一定程度上反映物质的内在质量[18-19]，而多元统计学既可以对指纹图谱的信息进行识别、处理，又可以将多个指标进行综合、降维和分类分析，从而更加客观、科学地反映爆珠香精的质量信息，最终达到控制该爆珠香精的整体质量的目的[20-21]。研究拟基于组学处理手段[22-25]，以正常爆珠香精样品和模拟爆珠香精样品为对象，采用气相色谱—质谱法对爆珠香精中挥发性及半挥发性化合物进行检测，建立目标样品色谱指纹图谱，再结合主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析等多元统计分析方法进行统计分析，同时结合t检验，以期筛选出爆珠香精特征香味标志成分，旨在为爆珠香精质量变化研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

软饮料加香用爆珠香精：果香香韵，同时制作用于建模对比分析需要的模拟样品，具体制作方法参照表1，云南巴菰生物科技有限公司；

表1 爆珠香精模拟样品制作方法

无水乙醇、乙酸乙酯：色谱纯，质量分数≥99%，比利时Acros公司；

正十七烷标准品：质量分数≥99%，美国Sigma-Aldrich公司；

气相色谱—质谱联用仪：7890B-5977A型，美国Agilent Technologies公司；

毛细管柱：DB-5MS型，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Agilent Technologies公司；

毛细管柱：DB-17MS型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Agilent Technologies公司；

毛细管柱：DB-Innowax型，30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国Agilent Technologies公司；

电子天平：T201型，瑞士Mettler Toledo公司；

振荡仪：HY-8型，常州国华电器有限公司；

有机相针头滤膜：0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 准确称量24颗爆珠香精样品，全部转移至50 mL锥形瓶中。用干净玻璃棒将爆珠香精全部捣破(暂不移出玻璃棒)，依次加入100 μL质量浓度为500 μg/mL的正十七碳烷乙醇溶液和10 mL乙酸乙酯，搅拌均匀，靠壁、拿出玻璃棒，于160 r/min下振荡萃取40 min，用0.22 μm有机相滤膜过滤，得待测液。

1.2.2 色谱条件

(1) 气相色谱条件：样口温度260 ℃；载气为氦气，恒流条件，流速1.0 mL/min；进样量1 μL；不分流进样；DB-17MS色谱柱；程序升温：初始温度50 ℃，以8 ℃/min升温至200 ℃，保持10 min，以20 ℃/min升温至280 ℃，保持25 min；传输线温度280 ℃。

(2) 质谱条件：电离方式为EI源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟3 min；检测方式为SCAN；扫描质量范围30～450 amu。

1.2.3 色谱柱优化 依照毛细管色谱柱极性递增顺序，依次考察DB-5MS、DB-17MS和DB-Innowax毛细管色谱柱对爆珠香精样品组分的分离影响，选择最佳分离色谱柱。

1.2.4 仪器和方法精密度 取1份爆珠香精正常样品进行处理后，连续进行6 次GC/MS分析，计算共有色谱峰相对于内标色谱峰面积比值的相对标准偏差(RSD)，考察仪器精密度；取6份爆珠香精样品处理后连续进样，计算共有色谱峰相对于内标色谱峰面积比值的RSD，考察日内精密度；取同一爆珠香精样品，隔天测定1次，共测定6次，计算共有色谱峰相对于内标色谱峰面积比值的RSD，考察其日间精密度。

1.2.5 数据处理 依据文献[26]中色谱指纹图谱提取方法对处理后的色谱数据(以目标物峰面积与内标峰面积的比值半定量方法计算)导出进行多变量分析；应用SIMCA 14.1软件对化合物数据进行中心化和归一化处理后进行PCA、OPLS-DA等多元统计分析，其中PCA用于识别正常爆珠香精样品与模拟爆珠香精样品之间挥发性、半挥发性成分间的相似性和差异性，OPLS-DA用于差异特征化合物的筛选，并使用SPSS 24.0软件对差异化合物进行单因素方差分析，筛选出特征香味标志物。

2 结果与分析

2.1 色谱柱条件优化及主要成分分析

爆珠香精的香气成分种类较多、含量相差较大，且极性差异较大[5-6]。由图1可知，各色谱柱均能有效分离爆珠香精内含物和壁材，其中前半部分为轻组分、易挥发的内含香味物质，后半部分为沸点较大、不易挥发的壁材物质。对于爆珠香精样品而言，随着色谱柱键合相极性的增大，内含香味物质中色谱峰面积较大的组分峰形变得更对称，且物质组分的整体响应丰度较壁材组分的响应丰度有所提升，但是壁材物质色谱峰峰形变差，且出现旗帜状色谱峰，同时前半部分与后半部分组分之间出峰时间间距加大。因此，优选键合相极性居中的DB-17MS毛细管柱为分离色谱柱。

图1 不同色谱柱条件下爆珠香精GC/MS色谱图Figure 1 GC/MS chromatogram of breakable capsule flavor under different chromatographic columns

进一步采用NIST库检索，依据色谱峰信噪比≥10且匹配度≥80%的原则进行定性分析，共鉴定出27种化合物，其中前半部分(内含物)1#～20#香味物质按照色谱峰保留时间递增顺序依次为2-甲基丁酸、蒎烯、柠檬烯、桧烯、月桂烯、松油烯、芳樟醇、辛酸甲酯、薄荷醇、松油醇、癸酸甲酯、对烯丙基茴香醚、香芹酮、癸酸乙酯、茴香脑、丁香酚、石竹烯、香橙烯、肉桂醛、月桂酸甲酯；后半部分(壁材)物质主要为辛癸酸甘油酯，21#～27#分别为单辛酸单癸酸甘油酯、二辛酸甘油酯、二癸酸甘油酯、单辛酸二癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、二辛酸单癸酸甘油酯)、三癸酸甘油酯等混合酯。研究[27]表明，该混合酯属于中链甘油三酯(MCT)，是一种新型中碳链脂肪酸甘油酯，由于其优良的溶解性能、低黏度等特点被广泛用于调配香味料、爆珠香精生产。

2.2 仪器和方法精密度考察

由图2可知，所有组分的精密度RSD介于0.56%～9.94%，平均值为2.83%，14#色谱峰RSD异常；日内精密度RSD介于3.07%～9.81%，平均值为5.93%，1#和19#两个色谱峰RSD异常；日间精密度RSD介于2.81%～11.95%，平均值为6.71%，11#、14#、17#和26# 4个色谱峰RSD异常。综上，只有个别组分RSD稍>10%，对于微量目标组分的量化分析而言，仪器及方法的日内及日间精密度较好，能够用于后续样品指纹图谱采集。

图2 爆珠香精目标组分分析精密度Figure 2 Analysis precision of breakable capsule flavortarget component

2.3 样品指纹图谱提取

图3为保留时间校正前后样品色谱峰局部组分匹配示例图，图4为经预处理后爆珠香精样品的GC/MS指纹图谱。由图4可知，经处理调整后能够有效排除色谱峰的保留时间飘移和重叠峰的干扰。建立好目标样品的GC/MS指纹图谱后，从软件中将色谱峰保留时间校正对齐后的色谱数据(半定量方法，以目标物峰面积与内标峰面积的比值计)导出进行后续多变量分析。

图3 保留时间校正前、后样品局部组分色谱峰匹配图Figure 3 Peak matching diagram of local components by retention time calibration before and after

图4 爆珠香精GC/MS指纹图谱Figure 4 GC/MS fingerprinting of breakablecapsule flavor

2.4 特征标志物筛选

2.4.1 主成分分析 由表2可知，当主成分数为4时，累计贡献率为87.1%；当主成分数为5时，累计贡献率仅增加为90.8%，对提升预测精度贡献不显著，所以适宜的主成分数应为4，基本上可以反映整体样本信息。

表2 爆珠香精PCA类模型的相关统计量

由图5可知，正常样品A与模拟样品B、C和D在95%置信椭圆内，并未有效分开，模拟样品B、C和D之间更是交叉在一起，个别模拟样品位于95%置信椭圆外，无法反映样品检测结果的差异性。由图6可知，所有正常样品和大部分模拟样品均在95% HotellingT2置信区间内，其中有3个模拟样品在99% HotellingT2置信区间内，未发现超出该置信区间的样本，有必要进一步对爆珠香精样品中挥发性、半挥发性组分进行OPLS-DA筛选研究。

A为正常样品，B、C、D均为模拟样品图5 爆珠香精主成分得分图Figure 5 PCA score plot of breakable capsule flavor

图6 爆珠香精PCA分析Hotelling T2分布图Figure 6 Hotelling T2 distribution of breakable capsule flavor

2.4.2 OPLS-DA筛选差异化合物 为确定爆珠香精样品特征香味标志物，使用OPLS-DA模型对样品进行分类，R2X、R2Y、Q2用于评估OPLS-DA模型的有效性，R2X、R2Y、Q2值越接近1，说明所构建的模型越好。由图7可知，R2X、R2Y和Q2值分别为0.986，0.890和0.675，正常样品A与模拟样品B、C和D在95%置信椭圆内分别处于第1主成分正负轴两侧，说明正常样品与模拟样品的挥发性、半挥发性成分得到了有效区分，在种类和相对含量上存在差异。进一步将建立OPLA-DA模型时定义分类Y的变量顺序随机排列200次以验证该OPLS-DA模型的可靠性[28]。由图8可知，R2和Q2回归线的斜率均>0，且截距分别小于0.5和0.05，表明该OPLS-DA模型具有良好的预测能力，可用于后续的特征标志成分寻找。

A为正常样品，B、C、D均为模拟样品图7 爆珠香精OPLS-DA得分图Figure 7 OPLS-DA score plot of breakable capsule flavor

图8 爆珠香精OPLS-DA模型置换验证图Figure 8 Permutation test of OPLS-DA model forbreakable capsule flavor

S-plot图中S形的位于左下方和右上方2个角上的变量是区分两组样品的主要香味物质，可反映每一个变量对已构建分析模型的贡献大小，即离中心原点和主要化合物团越远的变量说明其所代表的挥发性、半挥发性物质对已构建模型贡献越大；也就是说，离中心原点和主要化合物团越远，其对正常爆珠香精样品和模拟爆珠香精样品的差异判别贡献越大。由图9可知，8#(辛酸甲酯)、11#(癸酸甲酯)与正常爆珠香精样品距离更近，且远离中心原点和主要化合物团，对构建模型贡献显著(P<0.05)；3#(柠檬烯)、16#(丁香酚)、25#(三辛酸甘油酯)与模拟爆珠香精样品距离更近，且远离中心原点和主要化合物团。

图9 爆珠香精OPLS-DA的S-plot图Figure 9 S-plot of OPLS-DA model for breakablecapsule flavor

变量重要性投影值(VIP值)越大，说明其在判别过程中贡献越大，在样品之间的差异越显著(通常认为VIP>1的变量是模型的重要特征标志物)。由图10可知，有7个香气组分VIP>1.0，分别是3#(柠檬烯)、25#(三辛酸甘油酯)、16#(丁香酚)、26#(二辛酸一癸酸甘油酯)、8#(辛酸甲酯)、22#(1,3-二辛酸甘油酯)和11#(癸酸甲酯)，可作为区分正常爆珠香精样品和模拟爆珠香精样品的潜在重要特征标志成分。

图10 爆珠香精挥发性、半挥发性组分变量权重重要性排序图Figure 10 Variable importance for the projection of breakable capsule flavor

2.4.3 差异化合物显著性分析 对于以上远离原点和主要化合物团及VIP值>1的变量，采用SPSS软件进行单因素方差分析来筛选特征挥发性物质，以P<0.01表示具有极显著差异的物质，结果见表3。由表3可知，3#(柠檬烯)、8#(辛酸甲酯)、11#(癸酸甲酯)及16#(丁香酚)4种物质对应的P值均<0.01，可作为区分正常爆珠香精与模拟爆珠香精之间的特征标志物，其中就各标志成分的特征香味而言，柠檬烯具有青酸带甜的新鲜的橘子—柠檬果香，香气轻飘、不持久，口味是甜、新鲜柑橘样香味；辛酸甲酯具有强烈的酒香、果香和甜橙香气，持久性好，味呈油腻—果香，有些甜橙味；癸酸甲酯具有酒香气息，浓郁强烈；丁香酚具有温和的新甜花香，浓且非常持久，有甜的丁香香味，主要用来调和花香、果香、辛香风味。总体来说，该系列标志物能够反映爆珠香精果香香韵的特点。

表3 潜在重要特征标志物单因素方差分析结果

3 结论

采用GC/MS对爆珠香精中挥发性及半挥发性化合物进行检测，共鉴定出27种化合物，其中前半部分是包埋的香味物质，后半部分为壁材物质，两部分成分在色谱柱上区分明显；兼顾内含物和壁材的色谱峰响应，优选键合相极性居中的DB-17MS毛细管柱为分离色谱柱，仪器精密度、日内精密度和日间精密度总体较好，能够满足微量目标组分的量化分析，结合ChemPattern软件近邻算法对图谱数据进行对齐，适合于建立爆珠香精样品GC/MS指纹图谱；主成分分析对不同状态爆珠香精样品区分不明显，而正交偏最小二乘法—判别分析结果较好，结合单因素统计分析筛选出柠檬烯、辛酸甲酯、癸酸甲酯和丁香酚4种化合物为特征标志成分，系列成分可反映香精样品果香香韵特点，可为爆珠香精质量控制提供参考依据。后续将对不同年份、厂家爆珠香精进行检测，并建立该类爆珠香精质量控制体系，以便实现该方法对更多年份、更多品牌的爆珠香精进行鉴别，从而使该方法在实际生产中得到应用。