鹅星状病毒卵黄抗体的制备及安全性、免疫效力研究

宋 扬，于 镭，梁宛楠，李 倩

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

星状病毒（Astrovirus）是一类无囊膜、呈球形的单股正链病毒，基因组长度在6.2 ～7.9 kb不等[1]。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物属和禽类星状病毒属，其中哺乳动物属根据宿主的不同又分为人星状病毒、猫星状病毒、猪星状病毒、绵羊星状病毒以及貂星状病毒；禽类星状病毒属包括鸭星状病毒（DAstV）、火鸡星状病毒（TAstV）、禽肾炎病毒（ANV）和鸡星状病毒（CAstV）[2]。2017年下半年以来，我国江苏、山东、辽宁、安徽及河南等地区的养鹅场陆续暴发了一种以痛风为主要症状的致死性传染病。该病主要引起4～20日龄鹅消瘦、跛行和瘫痪，死亡率可达30%以上，剖检表现为关节和内脏器官的大量尿酸盐沉积，且疾病的发生与鹅的品种、饲料配方、饲喂量等均无关[3]。多项研究结果已经证实该病是由新型的鹅源星状病毒（Goose astrovirus，GAstV）引起[4]。由于该病目前尚无有效的疫苗和抗体用于预防，因此给我国的养鹅业造成了重大的经济损失。

为有效控制该病的发生，本研究用哈药集团生物疫苗有限公司研发中心前期分离鉴定的GAstV-DT株制备灭活疫苗免疫产蛋鸡，采集高免鸡蛋通过酸化水-辛酸法制备卵黄抗体，并对卵黄抗体的安全性及免疫效力进行评价，以期为GAstV卵黄抗体的应用提供参考依据。

1 材料

GAstV-DT株，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心分离保存；1、3、4、7日龄健康易感雏鹅，11日龄健康易感鹅胚，购自哈尔滨市双城区白长顺孵化场；18～22g清洁级小白鼠，购自哈尔滨医科大学附属第二医院；120～130日龄海兰褐产蛋鸡，购自哈尔滨岩鹤养鸡专业合作社；醋酸钠、冰醋酸、正辛酸、氯仿、聚乙二醇（6000）、硫酸铵，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 灭活疫苗的制备

取GAstV-DT株毒种，用生理盐水进行100倍稀释，尿囊腔接种11日龄健康易感鹅胚，收获24～168h死亡鹅胚尿囊液。将收获的尿囊液（病毒含量≥10-5.0ELD50·0.2 mL-1）加入终浓度为0.2 %的甲醛溶液中，37℃灭活24h，灭活检验合格后将病毒液与白油佐剂按1∶2比例混合，充分乳化制成灭活疫苗。

2.2 蛋鸡免疫程序的优化

将40只产蛋鸡随机分成A、B、C、D4组，每组10只。A组首次免疫0.5 mL灭活疫苗，在首免后的第21天和42天再次免疫灭活苗1.0 mL和1.5 mL。B组首次免疫1.0 mL灭活疫苗，在首免后的第21天和42天再次免疫灭活苗1.5 mL和2.0 mL。C组首次接种1.0 mL病毒液，之后与B组进行相同的免疫。D组为阴性对照组，不进行免疫。每组均采用胸部肌肉注射方式进行免疫。在首次免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、60d、90d、120d、150d和180d收集鸡蛋，制备卵黄抗体，进行抗体中和效价的测定。

2.3 卵黄抗体的制备及检测

将高免蛋（效价不低于1∶128）分别采用氯仿法、聚乙二醇法和饱和硫酸铵法制备卵黄抗体[5]，同时采用酸化水-辛酸法进行卵黄抗体的制备，即将高免蛋浸入0.1%的二氯异氰尿酸钠水溶液中消毒15min，去蛋壳分离卵黄。量取卵黄液体积，加入其8倍体积的醋酸缓冲液（0.12 mol·L-1，pH值5.0 ）充分搅拌，调pH值5.2 ，静置16h。取上清液加入终浓度为1.5%的正辛酸，室温下静置16h，取上清液，调pH值为7.2。上清液分别经孔径为1.0 μm和0.45 μm的滤器过滤，再经截留分子量为100ku超滤膜包浓缩复水3次。浓缩液加入终浓度为0.05%甲醛溶液，室温灭活24h，即为制备的卵黄抗体。将GAstV病毒液稀释成200ELD50/0.2 mL，与等量2倍系列稀释的待检卵黄抗体混合，置37℃下作用1h。每个稀释度经尿囊腔接种11日龄健康易感鹅胚5枚，每胚0.2 mL，同时设病毒对照（接种同条件处理的病毒液和生理盐水混合液）5枚，置37℃培养168h，记录24～168h鹅胚的存活和死亡数，按Reed-Muench法计算卵黄抗体中和效价，并根据参考文献[6]对卵黄抗体进行SDS-PAGE检测。

2.4 卵黄抗体靶动物安全性试验

将卵黄抗体以单剂量（0.5 mL·只-1）颈部皮下接种1日龄易感雏鹅10只，同时设置相同数量的未注射雏鹅作为对照，观察14d，观察记录雏鹅的注射部位变化、精神状态及存活情况。

2.5 卵黄抗体效价与攻毒保护相关性分析

取1日龄健康易感雏鹅80只，随机分为A、B、C、D4组，每组20只。A～C组为免疫组，分别颈部皮下接种效价为1∶64、1∶128和1∶256的卵黄抗体，0.5 mL·只-1；D组为攻毒对照组，颈部皮下接种同等剂量的生理盐水。接种抗体24h后，对照组和免疫组雏鹅颈部皮下接种GAstV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50）。各组隔离饲养观察10d，统计各组雏鹅的发病数，分析不同效价卵黄抗体与雏鹅攻毒保护的相关性。

2.6 卵黄抗体最小免疫剂量试验

取3日龄健康易感雏鹅100只，随机分为5组，每组20只。A～D组为免疫组，分别按0.1 mL·只-1、0.25 mL·只-1、0.5 mL·只-1和1.0 mL·只-1接种卵黄抗体；E组为攻毒对照组。接种抗体24h后，对照组和免疫组雏鹅颈部皮下接种GAstV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50），各组隔离饲养观察10d，统计各组雏鹅的发病数，计算保护率。按相同的分组方法和免疫攻毒方式进行4日龄和7日龄雏鹅的最小免疫剂量试验。

2.7 卵黄抗体免疫保护产生期和免疫持续期试验

取1日龄雏鹅360只，随机分为A、B2组，每组180只。A组为免疫组，颈部皮下接种抗体，0.5 mL·只-1；B组为攻毒对照组，颈部皮下接种相同剂量的生理盐水。接种抗体后2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d和10d分别从对照组和免疫组中各随机抽取雏鹅10只，颈部皮下接种GAs⁃tV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50），攻毒后各组隔离饲养观察10d，统计雏鹅发病数，计算保护率。

3 结果与分析

3.1 蛋鸡免疫程序优化

按不同免疫方案对产蛋鸡进行免疫，分别测定各组蛋鸡在免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、60d、90d、120d、150d和180d的卵黄抗体中和效价（见图1）。结果显示，首免7d后，A、B、C组抗体水平快速上升，免疫后49d抗体效价达到峰值8.8 lg、10.5 lg和8.2 lg，随后效价缓慢下降，分别于免疫后150d、180d和120d降至7.0 lg以下。表明首次免疫灭活苗1.0 mL，首免后21d和42d再次免疫灭活苗1.5 mL和2.0 mL的免疫程序抗体峰值效价最高，有效抗体效价（7.0 lg以上）维持时间最长，免疫效果最佳。

图1 不同免疫程序免疫产蛋鸡卵黄抗体效价测定结果

3.2 卵黄抗体的制备及检测

将4种不同方法制备的卵黄抗体分别进行中和效价测定和SDS-PAGE电泳检测。结果显示，酸化水-辛酸法、聚乙二醇法、饱和硫酸铵法和聚乙二醇法制备卵黄抗体的中和效价分别为1∶445.7、1∶388.0 、1∶362.0 和1∶337.8 ，使用酸化水-辛酸法较其他3种方法获得的卵黄抗体效价高。SDSPAGE电泳检测中，酸化水-辛酸法和饱和硫酸铵法制备的卵黄抗体在67ku和23ku处有两条目的条带（重链和轻链），杂蛋白较少；聚乙二醇法和氯仿法有大量的杂蛋白条带（见图2），表明酸化水-辛酸法和饱和硫酸铵法制备的卵黄抗体纯度更高。

图2 不同方法制备的卵黄抗体SDS-PAGE电泳结果

3.3 卵黄抗体靶动物安全性试验

卵黄抗体以单剂量、单剂量重复和超剂量接种1日龄易感雏鹅，观察期内易感雏鹅100%健活，接种部位无红肿、结节等不良反应，精神状态良好，行为、采食及饮水均未见异常，与对照雏鹅无可见差异。表明卵黄抗体安全性良好。

3.4 卵黄抗体效价与攻毒保护相关性分析

将不同效价的卵黄抗体接种3日龄雏鹅，接种24h后攻毒，中和效价为1∶64、1∶128和1∶256的卵黄抗体对雏鹅的保护率分别为65%、80%和100%；攻毒对照组雏鹅发病率为95%（见表1）。该结果表明卵黄抗体中和效价与攻毒保护呈正相关关系，在抗体效价不低于1∶128时能对雏鹅产生有效保护。

表1 鹅星状病毒卵黄抗体效价与攻毒保护相关性结果

3.5 卵黄抗体最小免疫剂量试验

卵黄抗体分别按0.1 、0.25 、0.5 和1.0 mL·只-1的剂量注射3日龄雏鹅，24h后攻毒，接种3日龄雏鹅的保护率分别为55%、80%、90%和100%；接种4日龄雏鹅的保护率分别为50%、60%、85%和100%；接种7日龄雏鹅的保护率分别为45%、55%、80%和100%。试验中健康对照组雏鹅100%健活，攻毒组发病率均为80%以上（见表2）。

表2 鹅星状病毒卵黄抗体最小免疫剂量测定结果

该结果表明卵黄抗体接种雏鹅能产生有效的免疫保护作用，抗体的最小免疫剂量为3日龄雏鹅0.25 mL·只-1，4日龄和7日龄雏鹅0.5 mL·只-1。

3.6 卵黄抗体免疫保护产生期和免疫持续期试验

卵黄抗体接种雏鹅后在不同时间段用GAstVDT株强毒对免疫雏鹅攻毒，结果显示抗体接种后2h、4h和6h的保护率均低于80%；接种后8h的保护率为80%；接种后14h的保护率达100%并持续至接种后第4d，接种后第5d保护率开始下降，接种后第6d保护率降至70%（见图4）。该结果表明，抗体免疫产生期为卵黄抗体接种后8h，免疫持续期为5d。

图4 卵黄抗体注射雏鹅后不同时间攻毒保护试验结果

4 讨论与结论

痛风也称尿酸盐沉积症，2017年以前学术界通常将该病的发生归结为营养因素[7]，如陈英辉[8]指出该病的发生主要是由于超量高钙与高蛋白饲料的使用；周红英[9]指出了同样的饲料配比问题。自2017年以来，我国部分地区陆续从鹅痛风典型症状的死亡鹅病料中分离到新型的鹅源星状病毒[10]。遗传进化研究发现，该病毒与之前报道的所有禽类星状病毒的基因型差异较大，临床上该病可引起病鹅的关节肿大、生产性能下降、死淘率可达到30%～50%；解剖可见心包、肾脏和肝脏等内脏表面有明显的白色尿酸盐附着，动物回归试验证明该病毒为痛风症状的致病病原[11]。由于鹅星状病毒为新型病毒，其与所有禽类星状病毒的基因型差异较大，因此由该病原引起的鹅痛风病目前尚无有效的商品化疫苗或抗体类生物制品能通过主动或被动免疫对其进行有效防治。

卵黄抗体是指产蛋鸡受特定抗原免疫后产生并转移和贮存在卵黄中的特异性抗体，从卵黄中将卵黄抗体提取并应用在动物疾病的防治中已得到广泛认可。目前，卵黄抗体的制备方法较多，但都存在工艺流程长、步骤多、试剂消耗量大、需大型离心设备等缺点，给产业化生产带来一定困难的同时增加了卵黄抗体的制备成本[12]。

本研究用哈药集团生物疫苗有限公司研发中心前期分离鉴定的GAstV-DT株制备灭活疫苗，按不同免疫方案免疫蛋鸡，在优化了蛋鸡免疫程序的基础上比较了酸化水-辛酸法与其他3种方法制备卵黄抗体的优势。酸化水-辛酸法制备的卵黄抗体具有效价高、纯度高、成本低、无需离心设备等优点，适合工业化大规模生产。尽管在制备中使用了化学试剂正辛酸，但辛酸在水中溶解度极低（0.062 g·L-1），在医学工业中正辛酸已被广泛应用，对生物无不良作用[12]，且本工艺中3次浓缩复水极大地降低了卵黄抗体中辛酸的残留量，提高了卵黄抗体的安全性。

抗体安全性和免疫效力是评价卵黄抗体使用效果的重要指标[13]，本研究根据《兽用生物制品实验室安全和效力试验技术指导原则》的要求，对黄抗体进了安全性和免疫效力评价。安全性试验结果显示，卵黄抗体接种非靶动物小鼠，小鼠全部健活，接种后无任何不良反应；抗体以单倍剂量、单剂量重复和2倍超剂量接种1日龄健康易感雏鹅，雏鹅全部健活，接种部位抗体吸收良好，雏鹅增重指标均与对照鹅无差异，表明该卵黄抗体安全性良好。

卵黄抗体效价与攻毒保护相关性试验结果显示，卵黄抗体效价与攻毒保护呈正相关，当卵黄抗体效价在1∶128以上时，对雏鹅能起到有效的保护作用；抗体最小免疫剂量试验结果显示，3日龄雏鹅最小免疫剂量为0.25 mL·只-1，4日龄和7日龄雏鹅最小免疫剂量为0.5 mL·只-1。但考虑到现地疫情复杂，雏鹅易受多种应激因素影响，为保证卵黄抗体的免疫效果，在实际应用中应中将接种剂量定为3日龄以下雏鹅0.25 mL·只-1；4日龄及以上雏鹅0.5 mL·只-1。由于卵黄抗体注射雏鹅产生的是被动免疫保护，其有效保护产生的时间比刺激机体免疫系统产生主动免疫保护的时间更早，免疫持续期更短。在抗体产生和免疫持续期研究中，通过不同时间点的免疫攻毒试验得出，卵黄抗体的免疫保护产生期为卵黄抗体接种后8h，免疫持续期为5d。

综上所述，本研究通过前期分离鉴定的GAs⁃tV-DT株制备了灭活疫苗并免疫产蛋鸡，采集高免鸡蛋，通过酸化水-辛酸法制备了卵黄抗体，该卵黄抗体安全、有效，适合工业化生产，可为我国防控鹅痛风病提供有效的防治手段。