牡丹籽粉对雌性小鼠生理指标的影响及其排泄规律研究

孙启亮，张惠喜，宋红卫，高英莉，肖 猛，魏戎蓉，朱 山，袁国良

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000）

牡丹籽为芍药科芍药属牡丹结的种子，是我国宝贵的民族药材资源，在藏药中可用于治疗皮肤病、炭疽和高烧，民间多用于治疗腰腿疼痛[1]。牡丹籽中含有芍药苷[2]、单萜糖苷[3]、白藜芦醇[4]等活性成分，具有抗菌、消炎、调节免疫等多种药理作用。而且，部分单萜苷类和芪类化合物为牡丹籽所独有，但药理作用未知，具有较高的研究价值。牡丹籽是一种特殊的中药材，除药用外，从中提取的牡丹籽油含有高比例不饱和脂肪酸[5]，具有较高的营养价值和保健价值[6]。2011年中华人民共和国卫生与健康委员会将牡丹籽油批准为新资源食品，这也使牡丹成为一种新型经济作物。牡丹籽粉是牡丹籽榨油后的副产物，可作为芍药苷的提取原料[7]；牡丹籽中蛋白质含量丰富，也可作为新型蛋白饲料来源[8]。合理开发牡丹籽资源，可以实现牡丹由单纯的观赏功能向经济作物功能延伸，对形成更加细分的牡丹产业链、提高牡丹种植者的收入具有重要意义。

本试验以雌性昆明种小鼠为研究对象，分别采用长期连续灌胃和一次性灌胃处理的方式，测定小鼠体重、脏器湿重、血清生化指标、血常规指标及排泄物中芍药苷含量等，评估牡丹籽粉对小鼠生理指标的潜在影响及排泄规律，以期为牡丹籽的合理利用提供基础数据支持。

1 试验材料

1.1 牡丹籽粉

牡丹籽粉，购自菏泽天宝牡丹生物科技有限公司，于4℃冰箱中保存，备用。

1.2 试剂与仪器

天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、谷氨酰转肽酶（GGT）试剂盒、总胆红素（TBil）试剂盒、总胆固醇（CHOL）试剂盒、总三酰甘油（TG）试剂盒、总蛋白（TP）试剂盒、白蛋白（ALB）试剂盒、肌酸激酶（CK）试剂盒、尿素（Urea）试剂盒、葡萄糖（GLU）试剂盒及钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）试剂盒，均购自北京豪迈生物科技股份有限公司；芍药苷标准品（纯度98.8%），购自Stanford Analytical chemicals公司；高效液相色谱仪（e2695），Waters公司产品；全自动生化分析仪（Humastar600），Human公司产品；血细胞分析仪（BC-5000vet），Mindray公司产品。

1.3 试验动物

昆明种小鼠，SPF级，雌性，42只，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。适应饲养1周，环境温度控制在20～26℃，相对湿度为40%～70%，维持12h光照，非灌胃期间自由采食全价日粮，每日观察小鼠健康状况。

2 试验方法

2.1 试验动物分组与处理

30只昆明种雌性小鼠按体重随机分为5组，分别为空白组、低剂量组（1.25 g·kg-1体重）、中剂量组（2.5 g·kg-1体重）、高剂量组（5.0 g·kg-1体重）和溶剂对照组。空白组自由饮水、采食，不作灌胃处理；将牡丹籽粉分别以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂稀释成相应剂量的混悬液作为剂量组；溶剂对照组按等体积灌胃法以0.5%羧甲基纤维素钠作灌胃处理。灌胃1次·d-1，持续8周。

2.2 生理指标测定

2.2.1 体重及脏器湿重

于试验开始当天对小鼠称重，之后每周称重1次，记录好数据。灌胃8周后观察小鼠的采食、饮水、发病及死亡等情况，解剖分离小鼠胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、卵巢、子宫等主要脏器进行称重，计算脏体比，脏体比=脏器湿重/单位体重[9]。

2.2.2 血清生化指标和血常规指标

用眼眶采血法分离血清和全血，血清用于测定AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl；全血用于测定白细胞（WBC）、嗜中性粒细胞百分数（Neu%）、淋巴细胞百分数（Lym%）、单核细胞百分数（Mon%）、嗜酸性粒细胞百分数（Eos%）、嗜碱性粒细胞百分数（Bas%）、红细胞（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、血细胞比容（HCT）、红细胞平均体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、血小板计数（PLT）。

2.3 牡丹籽粉排泄规律研究

2.3.1 牡丹籽粉中芍药苷的提取与净化

称取牡丹籽粉样品1g，置于250mL锥形瓶中，以料液比1∶20加入70%乙醇溶液，浸泡1h，超声提取10min。静置，取上清液稀释后过0.22 μm滤膜供液相色谱检测。

2.3.2 牡丹籽粉中芍药苷的排泄及消除规律

将12只昆明小鼠随机分为4组，单笼饲养，分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。按生理指标测定试验设计的剂量一次性灌胃给予牡丹籽粉，分别在试0～12、13～24h依次间隔12h收集粪便和尿液至灌胃后72h，将每次收集到的小鼠粪便称重、研细、混合均匀后置于250mL锥形瓶中，余下操作同牡丹籽粉中芍药苷的提取与净化。将每次收集到的小鼠尿液置于10mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，混匀，稀释后取上清液过0.22 μm滤膜供液相色谱检测。排泄率=检出量/总检出量；消除率=（总灌胃量-总检出量）/总灌胃量。

空白组小鼠不予灌胃，分别收集粪便和尿液作为空白样。灌胃后小鼠自由采食和饮水。

2.4 色谱条件

色 谱柱 为Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，250mm×4.6 mm；流动相为甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（40∶65V/V）；检测波长为230nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10μL；柱温：30℃。

2.5 统计学分析

利用IBM SPSS Statistics22软件对试验数据进行t检验和单因素方差（one-way ANOVA）分析，结果用“平均值±标准差”表示。

3 结果与分析

3.1 生理指标的测定

3.1.1 小鼠体重变化情况

体重数据见表1。

分别将低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠体重与相应周次的空白组小鼠体重相比，由表1可知，各组数据差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 试验小鼠各阶段的体重 g

3.1.2 脏体比测定

试验结束后解剖小鼠，各组小鼠胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、卵巢、子宫组织均未见明显异常。脏体比结果见表2。由表2可知，灌胃8周后，小鼠低、中和高各剂量组与空白对照组小鼠的脏体比数据之间差异均无统计学意义（P＞0.05），表明经口灌服的牡丹籽粉对小鼠脏器没有显著影响。

表2 各组试验小鼠的脏体比

3.1.3 小鼠血清生化指标

血清相关生化指标检测结果见表3。雌性小鼠经灌胃8周后测定的15项生化指标与空白组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组试验小鼠的血清生化指标

3.1.4 小鼠血常规指标

采集各组小鼠血液用肝素钠抗凝，进行血常规检测，结果见表4。

表4 各组试验小鼠的血常规指标

与空白组相比，各剂量组测定的12项血常规指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 排泄规律研究

3.2.1 芍药苷的线性范围、回归方程、检测限及定量限

取芍药苷标准贮备液适量，用流动相稀释成浓度为10、20、50、100、200μg·mL-1的标准工作液，进行HPLC测定，每个浓度的标准工作液测定3次，10μg·mL-1芍药苷标准品色谱图见图1。

图1 芍药苷的标准色谱

将各浓度与对应峰面积均值作线性回归，即得线性方程。结果表明，标准溶液线性范围在10～200μg·mL-1时，其线性方程为：y=1.31 ×104x+6.16 ×103（r2=0.999064 ）。通过测定信噪比（S/N）确定其检测限（S/N=3）。芍药苷在尿液和粪便样品中的最低检测限分别为1.15 mg·kg-1、0.588 mg·L-1。

3.2.2 回收率与精密度

分别向空白组小鼠粪便和尿液样品中加入适量标准溶液，使芍药苷浓度分别为5、10、20μg·mL-1，按照样品制备方法处理后经HPLC检测。回收率采用回归方程拟合计算。每个浓度5个平行，计算相对标准偏差。芍药苷在小鼠尿液和粪便中的回收率见表5，可见芍药苷回收率为73%～100%，相对标准偏差为0.35 %～10.85 %，满足定量分析方法的需要。

表5 芍药苷在小鼠粪便和尿液中的回收率 %

3.3 芍药苷的消除规律

小鼠一次性灌服牡丹籽粉后，在给药0～72h时间段的尿液中芍药苷含量均在检测限以下；在粪便中的检出数据及排泄率、消除率见表6～表7。

由表6～表7可知，在0～24h和25～48h内均能检测到芍药苷，48～72h内的数据在检测限以下。

表6 一次性灌服牡丹籽粉后粪便中芍药苷的检出量及排泄率

表7 芍药苷总灌胃量及消除率

4 讨 论

4.1 生理指标测定

连续灌胃8周后，雌性小鼠空白组胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、卵巢、子宫等器官的脏体比指标和血清AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl含量水平以及血液WBC、Neu%、Lym%、Mon%、Eos%、Bas%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PLT水平与对照组相比均无统计学意义。这些结果说明牡丹籽粉对雌性小鼠的生长性能无影响，对脏器无损伤。

试验动物生理指标是反映动物生长性能的参考指标，也是评估脏器功能的基础依据[10]。在肉鸡基础日粮中分别按5%、10%的比例添加牡丹籽粕，与基础日粮组相比，肉鸡日采食量显著降低而平均日增重和血生化指标以及血常规指标无显著差异，提示此剂量的牡丹籽粕可提高饲料利用率，且此剂量下肉鸡脏器未见损伤[11]。由于牡丹籽中含有的多糖具有良好的抗氧化性能[12]，试验组日粮中含有的牡丹多糖对脏器的保护作用与生理指标变化的相关性尚需试验进一步验证。

4.2 牡丹籽粉排泄规律

牡丹籽含有多种活性化合物，包括单萜苷类、低聚芪类、鞣质类、三萜和甾体类、黄酮类、丹皮酚类、多糖等。这些化合物以芍药苷含量相对最高，且含有的芍药苷类似物多达十几种[13]，所以芍药苷可以作为标志物用来评估牡丹籽粉在小鼠体内的排泄规律。经一次性灌胃后排泄物中检测到的芍药苷总量结果显示，低、中、高剂量的牡丹籽粉排泄率在0～24h之内均在90%以上，在49～72h之内完全排泄；各剂量组中芍药苷经代谢消除的比例分别为76.2 %、54.0 %和54.5 %，提示随着灌胃剂量从中剂量提高到高剂量，芍药苷的消除率未发生变化，可能原因是牡丹籽粉蛋白质含量丰富[14]，对芍药苷的代谢产生了保护效应。

5 小 结

本试验采用长期连续灌胃和一次性灌胃的方式分别采用不同剂量（1.25 、2.5 、5.0 g·kg-1体重）牡丹籽粉处理小鼠，用小鼠体重、脏体比、血清生化指标、血常规等参数进行评估，用粪便和尿液中芍药苷的含量对牡丹籽粉的排泄规律进行初步研究，发现牡丹籽粉对雌性小鼠的生长无影响，其对雄性小鼠的影响尚需要进一步研究。