广南县杉木三种侵染性病害病原鉴定

韩雨庭，唐婕，尼玛此姆，马焕成，伍建榕，

(1.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，西南林业大学生物多样性保护学院，云南昆明 650224；2.西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，西南林业大学林学院，云南昆明 650224)

杉木Cunninghamia lanceolata是松柏目杉科杉木属的一种重要的用材树种[1]。杉木属于常绿针叶乔木，因其生长速度快、主干通直、材质轻柔细腻、木材便于加工等特点，在家具生产、船只建造和建筑等领域被广泛应用[2－3]。杉木是云南省文山州广南县重要的乡土树种之一，从20世纪70年代末开始被广泛种植[4]。随着广南县多措并举开展实施林业工程项目，杉木已成为面积最大的用材树种[5]。近几十年，随着杉木人工林面积的急剧扩大，加之在同一林地上大面积集中连片栽种等，杉木人工林的弱点逐渐显露，多种病害不时发生，猖獗危害[6]。

2019年广南县杉木幼林出现大范围的黄化、枯死现象，对当地的经济造成了巨大影响。据调查，广南县3个人工杉木幼林病害症状均为针叶褪绿和枯死，病斑上可见大小不一的圆形或梭形小黑点，且病害轻重不一，可能为侵染性病害。为摸清杉木主要的侵染性病害种类和发病情况，减少侵染性病害对杉木生长和材积的危害，笔者对杉木人工林的侵染性病害发生情况进行调查，同时对病原菌进行分离鉴定及致病性测定，以期为病害防治和培育抗病品种等工作提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 感病和健康杉木枝条采自广南县珠街镇小鱼沟村、竜达寨子和曙光乡革洛村小组的杉木人工林。供试试剂Ezup柱式真菌基因组DNA抽提式试剂盒、引物ITS1和 ITS4均为生工生物公程(上海)股份有限公司生产。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.2 病原菌分离 选取感病的杉木针叶，采用常规的组织分离法[7]对病原菌进行分离。将纯化好的菌株接种于PDA斜面试管中，于4℃保存菌种。

1.3 病原菌形态鉴定 将获得的代表性纯化菌株移接至PDA培养基上25℃培养，观察并记录菌落的形状、色泽、生长速度等，在显微镜下观察并记录分生孢子的类型、形状和大小等。选择症状明显的针叶材料，对病部用徒手切片法[8]切取针叶横切片，在显微镜下观察病原形态。

1.4 致病性测定 将纯化后的病原真菌(KS－10、TJ－2)在 PDA平板上25℃培养7 d，用无菌水冲洗，配制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液。采用针刺接种法[9]，每个处理选取5段健康无病斑的杉木小枝，在每个小枝上选取10个针叶进行接种。采用喷雾法将配制好的孢子悬浮液接种在健康杉木的针叶上，设2种病原菌单独接种、先接种KS－10再接种TJ－2、先接种TJ－2再接种KS－10，共4个接种病原菌处理，对照处理用无菌水代替孢子悬浮液。待接种针叶上产生病斑后，对病斑进行病原菌再分离和鉴定，完成柯赫氏法则验证。

1.5 病原菌分子生物学鉴定 将纯化后的单个菌落作为真菌 DNA提取的材料。利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒对代表菌株的DNA进行提取。采用真菌通用引物 ITS1/ITS4对上述DNA提取物进行PCR扩增[10]，PCR产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。所得序列分别在GenBank数据库中的 BLAST程序 (www http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)与库中序列进行比对，下载同源性较高的序列。通过 MEGA 6.0中的最大似然法(Maximum Likelihood，ML)进行系统发育进化树的构建。

1.6 病害发病程度调查 在广南县的杉木林中随机选取150株，对3种侵染性病害进行调查。依据表1中杉木侵染性病害的分级标准，计算发病率和病情指数。

表1 广南县杉木侵染性病害分级标准Tab.1 Disease grading standard of Chinese fir infectious diseases in Guangnan county

发病率(%)＝发病株数/调查总株数×100

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

2 结果与分析

2.1 杉木炭疽病

菌落特征 分离物KS－10在PDA培养基上，菌落初期圆形，气生菌丝白色，棉花状，反面浅橘黄色；生长后期，以菌落中心为圆心，有浅橘色和黑色渗出物，为分生孢子液滴(图1A)。

形态特征 该病原菌分生孢子盘散生，暂未发现刚毛；分生孢子梗光滑，无色，1～2个细胞(图1B)；分生孢子透明，无隔膜，直，圆柱状，两端钝圆，大小为(15.2～18.7)μm × (4.4～5.8)μm(图1C)。

图1 暹罗刺盘孢的菌落和分生孢子Fig.1 Colony and conidia of Colletotrichum siamense

分子生物学鉴定 构建菌株KS－10的分子系统树，如图2所示。菌株 KS－10与参考菌株C.siamense(KP703372、 KP703373、 KP703390、LC208833、LC260488、LC260489、LC420017)位于同一分支，节点自展值为89，与其他近缘种保持较远的亲缘距离。

图2 基于ITS基因采用最大似然法构建的杉木炭疽病病原菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir anthracnose by maximum likelihood method

鉴定结果 结合形态学特征和分子生物学鉴定，确定杉木炭疽病的致病菌为暹罗刺盘孢C.siamense，属于炭疽菌属Colletotrichum，是子囊菌门Ascomycota粪壳菌纲Sordariomycetes小丛壳科Glomerellaceae小丛壳属Glomerella的无性态。这是国内外C.siamense在杉木上的首次报道。

致病性 接种病原菌KS－10孢子悬浮液5 d后，健康杉木的针叶出现黑褐色坏死斑(图3A)，而对照组无明显变化，未出现感病症状(图3B)。对发病组织进行病原物的再次分离，获得的病原菌与接种的病原菌株KS－10相同，完成了柯赫氏法则的验证，证明菌株KS－10是杉木炭疽病的致病菌。

广南县杉木炭疽病梢枯型与叶枯型混杂，大面积发生。梢枯型多为梢头10 cm以内的嫩梢茎叶发病，病斑没有明显的界限，严重时整个针叶红褐色枯死。叶枯型多从针叶顶尖开始发病，产生较小坏死病斑，初期可见病健交界处明显呈暗褐色，后期针叶枯死，呈灰白色(图3C)。

图3 暹罗刺盘孢对杉木的致病性Fig.3 Pathogenicity of Colletotrichum siamense to Chinese fir

2.2 杉木赤枯病

菌落特征 分离物TJ－2在PDA培养基上，菌落初期圆形，边缘平滑；气生菌丝白色絮状，生长速度快；反面浅橘色；生长后期，有散生的黑色墨汁状渗出物，为分生孢子盘(图4A)。

形态特征 该病原菌的分生孢子盘为深棕褐色；分生孢子梗光滑无色(图4B)。分生孢子5个细胞，(18.4～30.0)μm ×(5.0～6.2)μm；中间 3个有色胞同为橄榄色，上2个有色胞颜色深，第3个颜色较浅；顶孢无色，具2～3根附属丝，长度为14.5～21.5 μm；基部无色胞锥形，具1根柄(图4C)。

图4 小孢拟盘多毛孢菌落和分生孢子Fig.4 Colony and conidia of Pestalotiopsis microspora

分子生物学鉴定 以盘色串孢属Seiridium cardinale(AF409995、AF377298)为外群，构建菌株TJ－2的分子系统树(图5)。菌株TJ－2与参考菌株Pestalotiopsis microspora(KT372347、 GQ855796、KY366172、MK064589、MK064588、JN314418)位于同一分支，节点自展值为87，与其他近缘种区分开来。

图5 基于ITS基因采用最大似然法构建的杉木赤枯病病原菌的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS gene of the pathogen of Chinese fir copper blight by maximum likelihood method

鉴定结果 依据形态特征和分子生物学鉴定，确定杉木赤枯病致病菌为小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora，属于半知菌类 Deuteromycotina腔孢纲Coelomycetes黑盘孢目Melanconiales拟盘多毛孢属Pestalotiopsis。

致病性 接种病原菌TJ－2的孢子悬浮液5 d后，健康杉木针叶接种点周围出现褐色坏死斑点(图6A)，对照组无明显症状(图6B)。对发病组织进行病原物的再次分离，获到的病原菌与接种的病原菌株TJ－2相同，完成了柯赫氏法则的验证，证明菌株TJ－2是杉木赤枯病的致病菌。

杉木赤枯病在广南县杉木林中与其他病害间杂发生。病菌在枝梢幼嫩的针叶上侵染，初期为褐色小点，后逐渐扩大形成圆形或不规则暗褐色病斑，病健交界处通常有赤棕色略隆起的交界线。发病后期针叶由深红褐色变灰白色，病斑上有微凸起的黑褐色子实体产生，最后导致针叶枯死(图6C)。

图6 小孢拟盘多毛孢对杉木的致病性Fig.6 Pathogenicity of Pestalotiopsis microspora to Chinese fir

2.3 杉木落针病

形态特征 子囊盘黑色，成熟时中央有条纵裂缝(图7A，B)；子囊棍棒状，略有短柄，内含8个子囊孢子(图 7C，D)；子囊孢子单孢，无色，线形，(45.0～80.0)μm ×(2.0～2.5)μm，在子囊内束状排列(图7E)；侧丝线性，顶端弯曲。

鉴定结果 通过病原菌形态特征的比对，与李本国 等[11]、边银丙 等[12]、魏景超[13]所描述的一致。因暂未有人从杉木上成功分离到杉木落针病的病原菌，本研究中也未成功分离到该病原菌，无法进行分子鉴定，根据前人的形态研究将广南县杉木落针病的病原暂定为子囊菌门Ascomycotina锤舌菌纲Leotiomycetes斑痣盘菌目Rhytismatales的杉叶散斑壳Lophodermium uncinatum Dark.。

杉木落针病在广南县的杉木上普遍发生。受害针叶初期褪绿变黄，随着病斑的扩展，针叶上形成黄红色斑块，最后整叶枯死。在枯死针叶上产生长椭圆形的黑色子实体，为病原菌的子囊盘(图7F)。

图7 杉叶散斑壳及其在杉木上的症状Fig.7 Lophodermium uncinatum and its symptoms on the Chinese fir

2.4 暹罗刺盘孢和小孢拟盘多毛孢的复合侵染将纯化后的2种病原菌 C.siamense(KS－10)和P.microspora(TJ－2)分别先后针刺接种5～7 d后，与一种病原菌单独接种相比，复合侵染的病斑明显增大，颜色明显加深(图8)，说明病原菌的复合侵染比单独侵染病害发生更严重。先接种KS－10再接种TJ－2的发病症状比先接种TJ－2后再接种KS－10的病斑明显增大(图8)，说明KS－10菌株的侵染性比TJ－2的侵染性强。接种后的症状表现为初期变为灰绿色，进而为黄褐色斑，最终变为赤褐色而干枯，病叶保湿后产生黑色霉点，与自然发病症状相同。发病组织经再分离后均获得原接种菌，其菌落形态、分生孢子及大小均与原接种菌KS－10和TJ－2真菌一致，而无菌水接种的叶片均未发病，符合柯赫氏法则。

图8 暹罗刺盘孢和小孢拟盘多毛孢复合侵染症状Fig.8 Symptoms of complex infection after inoculation with C.siamense(KS－10)and P.microspora(TJ－2)

在病原菌分离过程中发现，从同一病枝上同时分离到C.siamense和P.microspora的概率比单独分离到其中一种病原菌的概率大2倍。致病性测定发现，两个菌种复合接种侵染比单独接种发病快、发病重，且先接种C.siamense比先接种P.microspora的杉木针叶病斑扩展速度快。结果表明，C.siamense和P.microspora复合侵染可以加重杉木病情，且C.siamense的致病力更强。

2.5 三种侵染性病害发病程度 病害发病程度调查统计结果显示，广南县杉木3种侵染性病害的发病率为91.33%，病情指数为52.33。该县杉木侵染性病害发生范围广且病情严重。

3 结论与讨论

国内外已有一些关于杉木病害的研究报道，其中杉木黄化病、杉木炭疽病(Glomerella cingulata)、杉木缩顶病(Pestalotiopsis guepinii)、杉木落针病(Lophodermium uncinatum)、杉木细菌性叶枯病(Pseudomonas cunninghamiae)、杉苗猝倒病(Fusarium spp.、Pythium spp.、Rhizoctonia solani)等多种杉木病害猖獗为害，造成了巨大的经济损失[14－18]。但关于几种病原菌复合侵染的调查未见报道。

本研究中，通过室外调查、室内试验和致病性测定发现广南县杉木林中杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落针病发生普遍，引起3种杉木侵染性病害的病原菌依次为暹罗刺盘孢Colletotrichum siamense、小孢拟盘多毛孢Pestalotiopsis microspora和杉叶散斑壳Lophodermium uncinatum。

暹罗刺盘孢C.siamense在热带、亚热带广泛分布，寄主繁多，侵染植株后可引起炭疽病[19]。自Prihastuti等[20]首次在咖啡豆上发现暹罗刺盘孢后，国内外报道不少植物都受到该病原菌的危害[21－22]，但没有关于该病原菌危害杉木的相关报道。目前，已有多次报道胶孢炭疽菌C.gloeosporioides可引起杉木炭疽病[14，18，23]，经查阅国内外的文献资料，未找到C.siamense引起杉木炭疽病的报道。笔者通过形态学观察、致病性测定，结合分子生物学鉴定，最终确定引起广南县杉木炭疽病的病原菌为暹罗刺盘孢C.siamense。这是世界范围内C.siamense引起杉木炭疽病的首次报道。

复合侵染试验结果显示，C.siamense和P.microspora复合侵染时病斑扩展速度大于两者单独接种，并且先接种 C.siamense比后接种C.siamense病斑扩展速度更快。廖旺娇 等[24]研究发现A和B混合接种病斑扩展速度不大于两者单独接种，这与本文研究结果相反，可能与侵入先后有关。韩晓勇等[25]研究发现C.siamense对紫山药有很强的致病力，这与本研究的结论相一致，说明暹罗炭疽菌是引起杉木病害的主要病原菌。

在本次调查研究中，广南县杉木3种侵染性病害的发病率为91.33%，病情指数为52.33。该县杉木侵染性病害广泛发生，且病情严重。病害调查时发现杉木炭疽病、杉木赤枯病和杉木落针病常常在同一株杉木上发生，并且病组织切片时发现C.siamense、P.microspora 和C.gloeosporioides经常混合出现在杉木的枯死针叶上。3种侵染性病害常常复合侵染，使得杉木病害严重发生，导致杉木生长停滞，针叶枝条大部分枯死，甚至整株枯死，很大程度上影响了杉木的正常生长和成材。

广南县杉木林地情况复杂，病害多样且严重，应多种防治措施并举。在杉木种植管理过程中，应适地适树[26]，加强抚育管理的同时做好病害预防[27]；及时除草除灌木，深翻松土，施加氮磷钾肥[28]。对已发生的病害及时清理病株及残体，做好病害防治管理，防止病害的进一步扩散[29]。在发病杉木林中，挑选抗病植株进行培育，筛选优良的抗病良种[30]。