不同盐度对四指马鲅幼鱼存活及鳃组织形态变化的影响

牛莹月 罗志平 区又君 蓝军南 温久福 李加儿 周慧

摘要：【目的】探究不同盐度对四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼鱼存活与鳃组织结构变化的影響，为四指马鲅苗种生产提供有效的技术支持和理论参考。【方法】试验设0、5‰、10‰（对照）、15‰和20‰等5个盐度组，将暂养于盐度为10‰水体中的四指马鲅幼鱼直接放入其他盐度水体中，试验第15 d时进行活体鳃组织取样，采用组织学方法对不同盐度条件下四指马鲅幼鱼的鳃组织结构进行研究。【结果】盐度为0时，四指马鲅幼鱼在12 h之内全部死亡，5‰盐度组幼鱼死亡率成为6.6%，10‰对照组幼鱼无死亡，15‰和20‰盐度组幼鱼死亡率分别为33.3%和60.0%，表明与高盐环境相比，四指马鲅幼鱼更能适应低盐环境，但不能在急性淡水胁迫条件下存活。显微结构观察结果显示，10‰盐度条件下，四指马鲅幼鱼的鳃小片排列紧密，线粒体丰富细胞主要分布在鳃小片基部。随着盐度增加，鳃小片的长度和间距减小，而鳃小片宽度增加。其中，5‰盐度条件下鳃小片的长度、宽度和间距分别为45.19±3.18 ?m、5.32±1.02 ?m和17.65±1.43 ?m，20‰盐度条件下鳃小片的长度、宽度和间距分别为36.67±3.81 ?m、8.78±2.22 ?m和11.56±3.81 ?m，差异均达显著水平（P<0.05）。20‰盐度条件下，鳃小片的远端可观察到线粒体丰富细胞，扁平上皮细胞出现一定程度的脱落或分离现象。扫描电镜观察结果显示，线粒体丰富细胞的顶膜结构分为Ⅰ型（顶膜向内凹陷）和Ⅱ型（顶膜向外凸起）2种类型。5‰盐度条件下，线粒体丰富细胞出现2种类型，主要以Ⅱ型为主，顶膜开口较大，表面有大量微绒毛，扁平上皮细胞表面有隆起的微嵴，形成指纹样回路;10‰盐度条件下，出现Ⅰ型线粒体丰富细胞，扁平上皮细胞表面微嵴形态不规则，细胞间的界限不明显;15‰和20‰盐度条件下，均以Ⅰ型结构为主，且随着盐度增加，顶膜加深，线粒体丰富细胞数量增多，扁平上皮细胞表面微嵴隆起幅度小，指纹样的回路不明显。【结论】当水体渗透压改变时，四指马鲅幼鱼存活率及鳃小片上细胞的数量分布和形态均发生显著变化，鳃组织结构的变化与其所处的环境盐度条件有关。

关键词： 四指马鲅;盐度;幼鱼;死亡率;鳃;组织结构

Abstract：【Objective】In order to explore the characteristics of the survival and gill histological structure of Eleutheronema tetradactylum juveniles cultured at different salinities，to provide effective technical support and theoretical reference for the production of E. tetradactylum. 【Method】Five salinity groups of 0，5‰，10‰ （control），15‰ and 20‰ were set up in the experiment. The juvenile E. tetradactylum temporarily raised in 10‰ salinity water was directly put into other salinity water bodies. The living gill tissue was sampled on the 15th day of the experiment. The histological structure of gill of E. tetradactylum juveniles under different salinities were observed by using the histological methods. 【Result】Under 0 salinity condition，E. tetradactylum juveniles all died within 12 h，at 5‰ salinity condition，the mortality rate was 6.6%，no death in the control group，the mortality rates of 15‰ and 20‰ salinity were 33.3% and 60.0% respectively. Compared with the high salt environment，E. tetradactylum juveniles was more adaptable to low-salt environment and could not survive in freshwater environment. The microstructure observation results showed that，at 10‰ salinity condition，the gill lamella of E. tetradactylum juveniles closely arranged closely，mitochondria-rich cells were distributed at the base of the gill patch. With the increase of salinity，the length and spacing of gill lamellae decreased，while the width of gill lamellae increased. At 5‰ salinity condition，the length，width and the intervals of gill lamella were 45.19±3.18 ?m，5.32±1.02 ?m and 17.65±1.43 ?m respectively. At 20‰ salinity condition，the length，width and the intervals of gill lamella were 36.67±3.81 ?m，8.78±2.22 ?m and 11.56±3.81 ?m respectively，the differences were all significant（P<0.05）. At 20‰ salinity condition，mitochondrial rich cells could be seen at the distal end of the gill patch and the pavement epithelial cells appeared to be detached or separated. The surface scanning of the gills showed the mitochondrial rich cells could be divided into two subtypes：subtype Ⅰ（embolic apical crypts） and subtype Ⅱ（shallow apical crypts）. Under 5‰ salinity condition，there were two types of mitochondria-rich cells. Most of which were type Ⅱ，the apical membrane had a large opening and there were a large number of microvilli on the surface. The surface of pavement epithelial cells was uplifted by the microridge，forming a fingerprint-like circuit. Under 10‰ salinity condition，mitochondria-rich cells showed typeⅠ structure，the microridge on the surface of pavement epithelial cells was irregular and the intercellular boundary distribution was not obvious. Under 15‰ and 20‰ salinity conditions，mitochondrial rich cells were dominated by type Ⅰ，with the change of salinity，the apical crypts gradually deepened，and the number of mitochondria-rich cells increased. The surface of the pavement epithelial cells had small ridges and the fingerprint-like circuit was not obvious. 【Conclusion】When the water osmotic pressure changes，the survival rate and the number distribution and morphology of the cells on the gills of juvenile E. tetradactylum，the histological structure of gill are affected by environment salinity.

Key words： Eleutheronema tetradactylum; salinity; juvenile fish; death rate; gills; histological structure

0 引言

【研究意義】四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗称马友、牛笋或午鱼等，隶属于鲻形目（Mngiliformes）马鲅科（Polynemidae）四指马鲅属（Eleutheronema）。四指马鲅主要分布在印度洋至西太平洋，尤其在波斯湾至巴布亚新几内亚、澳大利亚北部和东亚（日本、中国和越南）沿海多有分布（Ballagh et al.，2012;Wang et al.，2014），因其肉质鲜美、生长迅速、抗病性强而受到广大消费者青睐，已发展成为近年来水产养殖的新品种（区又君等，2018）。水体盐度是鱼类生存的重要环境影响因子之一。鱼类通过自身调节来维持体内外渗透浓度的平衡，对水环境变化的适应能力取决于其自身的渗透调节能力（于娜等，2012）。四指马鲅适应盐度范围广，当水体渗透压发生改变时，机体自身会产生一系列应激反应以适应环境变化，当盐度超出其耐受能力时会引起机体死亡，从而导致养殖业生产力下降。鱼类的鳃组织不仅是主要的呼吸器官，还参与渗透压调节、离子平衡及体液pH调节等，在盐度适应过程中发挥至关重要的作用（侯俊利等，2006;陈世喜等，2017;龚仕玲等，2019）。因此，加强四指马鲅幼鱼鳃组织对盐度适应性的研究，了解其组织结构的变化机制，对促进四指马鲅养殖业的健康高效发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，国内外从诸多方面对四指马鲅进行了研究，主要包括胚胎发育观察（谢木娇等，2016）、亲鱼初次性成熟和苗种规模化繁育技术（区又君等，2017）、DNA条形码分析及SCAR分子标记开发（杨翌聪等，2019）、光周期对其视网膜结构和视蛋白表达的影响（周慧等，2019）、群体遗传及其多样性（Ismail et al.，2019）、精巢发育及精子发生（蓝军南等，2020）及室内循环水和池塘养殖体质量与形态性状的相关性（李俊伟等，2020）。关于四指马鲅鳃组织的研究也有少许报道，罗海忠等（2015）研究发现，水体盐度高于等渗点时，随着水体盐度增加，四指马鲅幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性也逐渐增加，表明四指马鲅幼鱼在高盐度水体中需消耗较多的能量以维持渗透压平衡;区又君等（2018）在研究急性低温胁迫对鳃组织结构的影响时发现，随着低温处理时间的延长，线粒体丰富细胞数目增多，鳃小片末端轻微膨大至鳃小片整体水肿且严重弯曲，表明鳃细胞的损伤程度均随水温降低而增强。关于运输胁迫对鳃组织结构的影响，刘奇奇等（2017）研究表明，未加入抗应激剂的幼鱼鳃小片肿胀，部分鳃小片胀破，线粒体丰富细胞体积变大且数量增多，表明运输胁迫破坏了四指马鲅鳃的渗透压调节功能。上述研究结果为本研究的顺利开展提供了前期基础。【本研究切入点】对于水体盐度变化，不同鱼类均有其特定的适应机制，在一定盐度变化范围内鱼类能正常生存，当盐度变化超过鱼类的适应能力，便会产生应激胁迫，严重时甚至导致死亡（林先智等，2015a;施永海等，2015;王雯等，2016a）。此外，当水体渗透压发生改变时，鱼类为适应盐度变化，其鳃组织结构及鳃小片上细胞的数量和形态均发生显著变化（区又君等，2013;刘娟娟等，2015）。目前，关于盐度对四指马鲅鳃组织形态变化影响的研究相对较少（罗海忠等，2015）。【拟解决的关键问题】通过组织石蜡切片及扫描电镜技术，观察不同盐度下四指马鲅幼鱼鳃组织适应性的变化特征，为四指马鲅苗种生产提供有效的技术支持和理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验所用四指马鲅幼鱼为本课题组在珠海试验基地培育获得，平均全长3.11±0.53 cm，平均体重0.224±0.014 g。试验开始前在室内暂养7 d，暂养盐度（10.0±0.5）‰，水温（27±2）℃，期间每天换水1次，每次换水量1/3，24 h连续充气增氧。暂养结束后，随机挑选体色正常、体格均匀健壮、活力强的个体共300尾鱼进行后续试验。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验设计 试验共设0、5‰、10‰（对照）、15‰和20‰等5个盐度组，每个盐度组设3个平行。以曝气自来水或海水晶调节盐度，将暂养于盐度为10‰水体中的四指马鲅幼鱼直接放入盐度为0、5‰、15‰和20‰的水体中，每个平行组20尾鱼。试验期间水温控制在26～28 ℃，连续24 h充氧，每天换水1次，每次换1/3，调节盐度，误差不超过0.5‰。每天9：00和17：00各投喂1次，喂食1 h后将残饵及粪便用虹吸法吸出。试验时间持续15 d。

1. 2. 2 样品采集与处理 在试验第15 d时，从各盐度组中随机选取3尾鱼，活体取鱼鳃组织，将鳃组织剪成小块分别置于4%多聚甲醛溶液和电镜固定液（Servicebio G1102）中固定备用。

鳃组织切片制作：将固定好的样品以流水冲洗12 h，用50%～100%梯度的乙醇进行脱水（50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2次、100%乙醇45 min×2次），用二甲苯进行透明（1/2无水乙醇+1/2二甲苯的混合液1 h、二甲苯15 min×2次），浸蜡（石蜡2 h×2次），用石蜡进行包埋，切片，采用苏木精—伊红（HE）进行染色，中性树脂封片。

扫描电镜样品制备：将固定好的样品用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）漂洗3次（每次15 min）。1%锇酸·0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）室温（20 ℃）固定1～2 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。依次放入50%→70%→80%→90%→95%→100%→100%酒精进行脱水，每次15 min。将样本紧贴于导电碳膜双面胶上放入离子溅射仪样品台上喷金30 s左右进行样本导电处理。将样本放入临界点干燥仪（QUORUM K850）内进行干燥。干燥完毕后在扫描电子显微镜（HITACHI SU8010）下观察，采集图像分析。

2 结果与分析

2. 1 不同盐度条件下四指马鲅幼鱼的死亡率

将暂养于10‰盐度条件下的四指马鲅幼鱼直接放入盐度为0、5‰、15‰和20‰的水体中。5‰、15‰和20‰组幼鱼刚开始集中于水底，静止不动，5 min后开始沿着水箱壁游动，之后行为逐渐恢复正常。盐度为0时，幼鱼刚开始集群伏于水底，之后在水箱中无方向窜动，出现狂游现象，且游动时身体侧翻，无法维持平衡，随后幼鱼的游泳速度逐渐变得缓慢，活动减弱，对外界刺激的反应减弱，12 h内全部死亡。试验期间，0盐度组幼鱼死亡率为100.0%，5‰组幼鱼死亡率为6.6%，对照组幼鱼均无死亡，15‰和20‰组幼鱼死亡率分别为33.3%和60.0%（表1）。

2. 2 不同盐度条件下四指马鲅幼鱼鳃组织显微结构的变化

图1和表2分别为不同盐度条件下四指马鲅幼鱼鳃组织显微结构及鳃小片的变化。5‰盐度条件下，鳃丝上的鳃小片为扁平囊状，排列紧密，几乎平行;与10‰对照组相比，鳃小片变窄变长且间距增宽;鳃小片外侧有扁平上皮细胞，呈长条状分布，鳃小片上的柱细胞呈X形或长梭形;线粒体丰富细胞主要分布在鳃小片基部，呈椭圆状，着色较浅，呈淡红色且数量少（图1-a）。10‰盐度条件下，鳃丝发达，排列紧密;鳃小片平行紧密排列，鳃小片上细胞饱满，细胞间无明显间隙;鳃组织结构无明显变化，柱细胞主要为X形或圆柱形;线粒体丰富细胞的分布、结构及数量变化均不明显，主要位于鳃小片基部，体积较小，细胞饱满，排列紧密，细胞核为蓝紫色，细胞质着色浅（图1-b）。15‰盐度条件下，鳃小片宽而短，且彼此的间隔较对照组窄，排列在鳃丝两侧;鳃小片上皮增厚，扁平上皮细胞呈鳞片状，与线粒体丰富细胞相邻，扁平细胞体积变大，呈长梭形，柱细胞为圆柱形;鳃小片基部的线粒体丰富细胞数量增加，但不明显;鳃小片上出现一些线粒体丰富细胞，胞体变大，主要呈长柱形或卵圆形，且着色深（图1-c）。20‰盐度条件下，鳃小片明显缩短，且彼此间隔变窄，甚至出现萎缩，尖端略膨大;柱细胞呈长梭形和椭圆形;幼鱼的鳃丝和鳃小片上线粒体丰富细胞数量显著增加，细胞明显增大，并逐渐向相邻的鳃小片扩散，两鳃小片间几乎全部被线粒体丰富细胞占据;此外，与鳃小片基部与线粒体丰富细胞紧密相邻的扁平上皮细胞呈三角形，并呈现出不同程度的脱落或分离现象（图1-d）。

2. 3 不同鹽度条件下四指马鲅幼鱼鳃组织微细的结构变化

图2为不同盐度条件下四指马鲅幼鱼鳃细微结构的变化。5‰盐度条件下，扁平上皮细胞呈多边形，排列紧密，表面密布微嵴，形成指纹状回路（图2-a）;鳃线粒体丰富细胞通过顶膜表面与外界环境相连，位于扁平上皮细胞边缘;线粒体丰富细胞出现2种类型，即顶膜稍向外凸、开口较大且表面有大量微绒毛和顶膜向内凹陷、开口较小且表面没有微绒毛;根据其顶模结构可将其分为Ⅰ型（顶膜向内凹陷）（图2-b）和Ⅱ型（顶膜向外凸起）（图2-c），其中Ⅱ型线粒体丰富细胞数量较多。10‰盐度条件下，扁平上皮细胞表面的环状微嵴形态不规则，且细胞间的界限分布不明显（图2-d）;相邻扁平上皮细胞间的开孔为线粒体丰富细胞的顶膜结构，仅分布在鳃丝鳃小片的基部，鳃小片上未发现有线粒体丰富细胞分布，对照组鳃线粒体丰富细胞的顶膜开口以Ⅰ型为主（图2-e）。15‰盐度条件下，扁平上皮细胞表面环状微嵴变少，边缘微嵴隆起幅度小，指纹状回路不明显（图2-f）;鳃线粒体丰富细胞的顶膜向内深陷形成顶隐窝，开口较小，且其表面无微绒毛;此盐度组仅出现线粒体丰富细胞Ⅰ型顶膜开口，未观察到线粒体丰富细胞Ⅱ型顶膜开口（图2-g）。20‰盐度条件下，扁平上皮细胞排列密集，形态与15‰盐度组相似，且其表面微嵴隆起幅度逐渐变小（图2-h）;与15‰盐度组相同，20‰盐度组也未发现粒体丰富细胞顶膜Ⅱ型开口，而Ⅰ型鳃线粒体丰富细胞的顶隐窝较15‰盐度组加深，数量增多（图2-i）。

3 讨论

3. 1 盐度对四指马鲅幼鱼存活率的影响

广盐性鱼类虽然对盐度有较强的适应能力，但在面对盐度胁迫时，仍需消耗大量能量以维持体内的渗透压平衡，盐度变化一旦超过其耐受能力范围，体内渗透压则无法恒定，最终导致组织器官受损及功能丧失，而影响其存活（林先智等，2015b;王雯等，2016a）。四指马鲅为典型的广盐性鱼类，本研究中将对照组10‰盐度条件下的四指马鲅幼鱼直接放入不同盐度环境中，试验开始阶段因盐度的急剧变化，造成各盐度组幼鱼不同程度的死亡，其中0盐度组幼鱼全部死亡，其余各组存活的试验鱼通过调节自身渗透压，逐渐适应盐度变化，进而存活率趋于稳定。结果显示，5‰和10‰盐度组四指马鲅幼鱼的存活率高于15‰和20‰盐度组，表明与高盐环境相比，四指马鲅幼鱼更能适应低盐环境，且不能在急性淡水胁迫条件下存活，与罗海忠等（2015）的研究结果一致。

3. 2 盐度对四指马鲅幼鱼鳃组织结构的影响

对大多数水生动物来说，鳃组织不仅是主要的呼吸器官，还在维持机体内外的渗透压平衡中发挥至关重要的作用。当水体盐度发生变化时，鱼类的鳃组织结构为适应环境也会发生相应变化（杨建等，2014）。本研究结果表明，与对照组10‰相比，生活在5‰低盐度水体中的幼鱼，其鳃小片变细变长，向外延伸，且间距增宽，与水体的接触面加大，通过摄取水环境中的无机离子以便于能在低渗环境中生存;15‰和20‰盐度组的试验鱼，其鳃小片变宽变短，间距变窄，鳃小片上有线粒体丰富细胞，线粒体丰富细胞通过主动运输来加强水氧的交换量，使其能更好地适应高盐环境。扁平上皮细胞是鳃组织结构的主要组成部分，主要以被动运输方式参与鳃的生理功能，其表面的微脊能进一步增加鳃组织与水体的接触面，起增强气体交换的作用（于娜等，2012;区又君等，2013）。本研究中，各盐度组幼鱼鳃小片远端的扁平上皮细胞变化差异相对较小，扁平上皮细胞主要呈鳞片状，细胞核变长;而在鳃小片基部的扁平上皮细胞的形态变化差异相对明显，随着水体盐度的增加，与线粒体丰富细胞相邻的扁平上皮细胞体积变大，形似长梭形或三角形，同时出现不同程度的脱落或分离现象（于娜等，2012;区又君等，2013）。这与前人对鲻（Mugil cephalus）及中华鲟（Acipenser sinensis）子二代幼鱼的研究结果相似（于娜等，2012;刘娟娟等，2015），表明在不同盐度胁迫条件下，四指马鲅幼鱼鳃组织结构发生了适应性变化。

3. 3 盐度对四指马鲅幼鱼线粒体丰富细胞的影响

鱼类鳃组织的线粒体丰富细胞主要负责离子的摄取和分泌（Inokuchi and Kaneko，2012;Yada et al.，2012;Kang et al.，2013;Kokou et al.，2019）。线粒体丰富细胞不仅能在低渗环境中吸收Cl-进行调节，还能在高渗环境中通过分泌Na+和Cl-完成自身调节（庄青青等，2012）。线粒体丰富细胞主要分布在鳃小叶的基部，其顶端小窝开口于鳃的表面，与外界环境直接接触。线粒体丰富细胞在鳃上皮中所占比例虽然不高，但在进行物质交换的过程中发挥着主动运输功能（于娜等，2012）。本研究结果显示，四指马鲅幼鱼存在2种线粒体丰富细胞，根据顶膜结构将其分为Ⅰ型（顶膜向内凹陷）和Ⅱ型（顶膜向外凸起）;低盐条件下的四指马鲅幼鱼，其鳃线粒体丰富细胞主要为Ⅱ型，细胞数量少，胞体小;高盐条件下四指马鲅幼鱼Ⅰ型线粒体丰富细胞分布在鳃小片基部的数量增加，并逐渐向相邻的鳃小片中间不断扩散。这与区又君等（2014）对遮目鱼（Chanos chanos）、王雯等（2016b）对斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的研究结果相似。区又君等（2013）在对卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的研究中发现，低盐条件下卵形鲳鲹鳃组织上的线粒体丰富细胞主要为Ⅱ型，无明显的泌氯功能，且代谢水平低，其主要通过离子交换来吸收水体中的无机盐及进行自身pH调节以维持体内外渗透压平衡。随着盐度增加，鳃上线粒体丰富细胞呈现出Ⅰ型结构，集中分布于鳃小片的基部，且向相邻的鳃小片扩散，其泌氯功能与代谢水平均较高，表明线粒丰富细胞在渗透压调节上发挥着非常重要的作用。线粒体丰富细胞结构及功能的适应性变化规律，是大多数广盐性鱼类能适应复杂多变的水体盐度的主要原因之一。

4 结论

当水体渗透压改变时，四指马鲅幼鱼存活率及鳃小片上细胞的数量分布和形态均发生显著变化，鳃组织的结构变化特征与其所处的环境盐度有关。

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（責任编辑 王 晖）