高效液相色谱法同时测定红旱莲中5个黄酮类成分的含量

王慧，辛爱玲，冯璐杰，任小凡，李元伟，董俊青（洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023）

红旱莲又名湖南连翘、黄海棠等，为藤黄科金丝桃属多年生草本植物黄海棠（Hypericum ascyronL.）的干燥地上部分[1]，具有凉血止血、活血调经、平肝消肿、清热解毒之功效[2]。在我国分布较广，除新疆、青海外，我国东北地区及黄河、长江、珠江流域均有分布。民间多用于止痛、抗菌消炎、治疗创伤等[3]。据研究报道，红旱莲含有丰富的黄酮类生物活性物质，其提取物具有降血脂、抗氧化、抗抑郁、抗病毒、抑制组胺释放等药理活性[4-8]。目前文献中对红旱莲总黄酮的研究比较多，但对其各部位黄酮类化合物分布的研究较少，且对于红旱莲的采收期、药用部位等虽有文献记载，但标准并不统一，如药用部位有全草入药和地上部分入药[8-10]。本研究以芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷5 个黄酮类成分作为指标成分，对不同产地、不同采收期、不同药用部位的红旱莲进行多组分含量分析及比较，为确立红旱莲适宜采收期和药用部位，完善红旱莲的质量标准及红旱莲资源的合理利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪、Agilent ChemStation 色谱工作站（美国Agilent Technologies 公司）；MSA225S-000-DU 电子天平（德国Sartorius公司）；BSA224S-CW 电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ-400DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药材

28 批红旱莲样品，经洛阳市食品药品检验所辛爱玲副主任中药师鉴定均为藤黄科植物黄海棠（Hypericum ascyronL.）的干燥地上部分，具体信息见表1。

表1 样品来源Tab 1 Source of samples

1.3 试药

对照品芦丁（批号：100080-200707，纯度：90.5%）、金丝桃苷（批号：111521-201507，纯度：94.3%）、槲皮素（批号：100081-201610，纯度：99.1%）、异槲皮苷（批号：111809-201804，纯度：97.2%）、山柰苷（批号：110861-202013，纯度：93.2%）（中国食品药品检定研究院）；乙腈、磷酸为色谱纯（DiKMA 公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～25 min，15%B；25～45 min，15%～55%B；45～50 min，55%～15%B）；流速为1.0 mL·min－1；检测波长为360 nm；柱温为35℃；进样量为10 μL。在此条件下，5 个成分与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均高于6000，对称性良好，空白溶剂对测定结果无干扰（见图1）。

图1 混合对照品溶液（A）、供试品溶液（B）及空白溶剂（C）HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance（A），sample solution（B）and blank solvent（C）

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷适量，加甲醇超声溶解并定容，制成每1 mL 分别含芦丁0.026 90 mg、金丝桃苷0.021 37 mg、槲皮素0.032 72 mg、异槲皮苷0.026 73 mg、山柰苷0.017 70 mg 的混合对照品溶液，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取过2 号筛的红旱莲粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声处理30 min（功率400 W，频率40 kHz），放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 µm 的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液适量，配制系列质量浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定。以各成分峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg·mL－1）为横坐标，进行线性回归，其回归方程和线性范围见表2。

表2 各种成分的线性关系Tab 2 Linerity of various constituents

2.4.2 精密度试验 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，记录色谱图并计算5 个化学成分峰面积的RSD。结果各组分色谱峰保留时间波动均小于0.2 min，芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷峰面积RSD分别为0.72%、0.81%、0.67%、0.23%、0.42%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批供试品（S9）溶液，室温下放置，分别于0、4、8、12、24 h 时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，测得芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷峰面积RSD分别为0.59%、0.47%、0.81%、0.42%、0.71%，表明供试品溶液在室温下放置24 h 稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批供试品（S9）约1 g，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算各成分含量及其RSD。结果芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷平均质量浓度分别为0.1562、0.3058、0.3233、0.5951、0.1840 mg·g－1，RSD分别为0.82%、0.96%、0.78%、0.43%、0.61%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验 称取已知含量供试品（S9）9 份，每份约1 g，分成3 组，精密称定，分别加入含芦丁0.0629 mg·g－1、金丝桃苷0.1226 mg·g－1、槲皮素0.2381 mg·g－1、异槲皮苷0.1293 mg·g－1、山柰苷0.0741 mg·g－1的混合对照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算5 个成分加样回收率均在98.27%～103.72%，RSD均在0.43%～0.75%。

2.4.6 样品含量测定 精密称取16 批不同产地的供试品（地上部分，见表3）、5 批产自或采自河南南阳的供试品（不同部位，见图2）及河南4 个产地不同采集时间的供试品（地上部分，见图3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件下平行进样2 次，记录色谱图，按外标法计算各组分含量。

图2 红旱莲不同部位5 个黄酮类成分总含量分布（mg·g－1）Fig 2 Total content of 5 flavonoids in different parts of Hypericum ascyron L.（mg·g－1）

图3 红旱莲不同采收期5 个黄酮类成分总含量比较（mg·g－1，n ＝16）Fig 3 Total content of 5 flavonoids in different harvest periods of Hypericum ascyron L.（mg·g－1，n ＝16）

表3 样品含量测定结果(mg·g－1)Tab 3 Content determination (mg·g－1)

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

比较不同品牌色谱柱[COSMOSIL Packed 5 C18-MS-Ⅱ（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglient ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agela venusil XBD C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）]对试验结果的影响，结果各成分色谱峰分离度均达到满意效果，证明该方法耐用性良好。

3.2 方法学条件的优化与选择

采用DAD 检测器在200～400 nm 波长对各考察成分进行光谱扫描，发现各成分均在360 nm波长处有较大吸收；对流动相、柱温、流速、提取溶剂、提取方式均进行了考察，在保证含量稳定、分离度、信号强度较好的前提下，以提取完全及节约时间成本为尺度综合考虑，最终确定了本研究所需的色谱条件。

3.3 含量测定结果分析

所有批次的红旱莲均检测出芦丁、金丝桃苷、槲皮素、异槲皮苷、山柰苷这5 个黄酮类成分。各产地之间5 个黄酮类成分总含量差异较大，其中南阳产的含量偏高；单个成分的含量槲皮素最高，依次是异槲皮苷、金丝桃苷、山柰苷、芦丁。5 批南阳产红旱莲不同部位的5 个黄酮类成分总含量也存在显著差异，依次为果实＞茎＞地上部分＞花＞叶＞根。这种差异可能与植物自身遗传因素、植物生长发育进程、所处生长环境有关，也可能与植物器官所承担的功能有关[11-12]。根据河南不同产地的红旱莲连续4 个月的考察结果可知，7～9月份5个黄酮类成分总含量相对较高，8月份达到最高，为红旱莲最佳采收时间提供了数据支持。

3.4 小结

本研究建立了高效液相色谱法同时测定红旱莲中5 个黄酮类成分含量的方法，并用此方法对红旱莲进行多组分、多角度的测定分析，为指导红旱莲的最佳采收时间和资源合理利用方面提供了科学依据。