基于聚类分析和主成分分析的广西小叶金花草高效液相色谱指纹图谱研究

陈锋，张颖，李嘉*（1.广西壮族自治区中医药研究院化学所，南宁 530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，南宁 530022）

小叶金花草来源于中国蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum（Thunb.）Kze.的全草，别名金花蕨、小野鸡尾、日本乌蕨等，为广西壮族和瑶族地区民间常用中药，其味苦，具有清热解毒、利湿、止血的功效，用于治疗风热感冒、肺热咳嗽、急性肠胃炎、黄疸、便血等[1]。小叶金花草在全区范围广泛分布，多野生于林下、河边、山坡灌丛阴处或石山上，主要含有黄酮、萜类、香豆素、酚酸和糖苷等化学成分。药理研究表明小叶金花草其提取物具有抗炎镇痛、解痉和解毒等作用[2-5]。目前未见小叶金花草在质量评价方面的相关报道，药材中的化学成分直接关系着药效，而中药化学成分复杂，单个或少数指标成分很难全面反映药材的质量。中药指纹图谱是研究中药质量标准的手段之一，它能反映中药的整体化学特征，可以在一定程度上区分中药的真伪与优劣，达到对质量的评价和控制[6-7]。主成分分析方法结合HPLC 指纹图谱既能降低原始数据处理的量级，又能保留大部分主要信息，解决中药质量在多元评价当中遇到的很多问题[8]。该模式能将化学成分群与药物药理进行分类，这有助于药效基础的研究和新药的开发[9]。本研究建立了广西13 批不同产地小叶金花草药材的HPLC 指纹图谱，并用对照品定性了其中部分共有峰，运用中药色谱指纹相似度评价系统软件及SPSS 统计软件进行聚类分析和主成分分析，旨在为其质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695 系列四元梯度泵高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XS205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KS-500DE 型超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）；KDM 型调温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。

1.2 试药

原儿茶酸（批号：110809-201205， 纯度：99.9%）、香草酸（批号：110776-201503，纯度：99.8%）（对照品，中国食品药品检定研究院）；咖啡酸（批号：MUST-18032003，纯度：99.48%）；菊苣酸（批号：MUST-18031720，纯度：99.33%）（对照品，成都曼思特生物科技有限公司）；乙腈（美国Fisher 公司，色谱纯），磷酸为分析纯，水为超纯水。药材经广西中医药大学韦松基教授鉴定为中国蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum（Thunb.）Kze.的全草，具体信息见表1。

表1 小叶金花草基原信息Tab 1 Material source information of Onychium japonicum(Thunb.) Kze.

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～60 min，10%→30%A；60～105 min，30%A）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：260 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 称取小叶金花草粉末1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇溶液30 mL，称重，加热回流1.5 h，放冷，再次称重后补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液 分别取原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、菊苣酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得含上述4 种成分质量浓度分别为5.07、8.26、6.53、32.46 μg·mL－1的混合对照品溶液，过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取供试品（S7）适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。结果表明，以8号菊苣酸色谱峰为参照峰时，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.00%～0.41%和0.27%～0.61%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取供试品（S7）溶液，分别于制备0、2、4、8、12、24 h 后，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。结果表明，以8 号菊苣酸色谱峰为参照峰时，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.96%～2.3%和0.37%～1.2%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 分别称取同一批供试品（S7）6 份，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。结果以8 号菊苣酸色谱峰为参照峰时，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.24%～0.77%和1.3%～3.6%，表明该方法重复性良好。

3 结果与分析

3.1 HPLC 指纹图谱的生成及相关分析

取13 批药材样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。将色谱图导入“中药色谱指纹相似度评价系统（2012版）”软件进行分析，以S7 号色谱图为参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，选择中位数法生成对照图谱R。13 批药材样品相似度在0.848～0.992，结果见表2，其中10 批药材样品相似度大于0.9，表明不同批次药材样品间差异不大。共确定了11 个共有峰，其中1、4、5、8号峰分别为原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和菊苣酸，混合对照品溶液色谱图见图1，13 批药材样品叠加指纹图谱见图2。其中8 号峰峰面积较大，且分离度和对称因子均符合要求，故设为参照峰。

表2 13 批样品HPLC 指纹图谱与对照图谱的相似度Tab 2 HPLC fingerprint similarity of 13 batches samples to the reference fingerprint

图1 混合对照品HPLC 色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of mixed control

图2 13 批样品的HPLC 叠加指纹图谱Fig 2 HPLC superimposed fingerprint of 13 batches of samples

3.2 聚类分析

以11 个共有峰的相对峰面积为原始数据，导入SPSS 25.0 软件，用平方欧式距离法测量，用组间数联接法对13 批小叶金花草进行聚类分析，结果见图3。13 批药材样品可聚类为三类：S2、S3、S8、S12、S13 聚为一类，这一类相似度结果均小于0.94；S1、S4、S6、S9、S10、S11 聚为一类；S5、S7 聚为一类。

图3 13 批药材样品聚类分析树状图Fig 3 Cluster analysis of 13 batches of samples

3.3 主成分分析

经SPSS 25.0 软件对各共有峰峰面积进行标准化处理后，对13 批小叶金花草药材指纹图谱的11 个共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征性及其方差，部分结果见表3。前三个因子累积方差贡献率达到84.643%，且特征根均大于1，可代表共有峰的大部分信息，故选择该3 个主成分因子。主成分载荷矩阵见表4，它反映了各变量对主成分的贡献程度，由表4可知，主成分1主要反映了香草酸、咖啡酸、菊苣酸和2、3、7、9、11 号峰的信息；主成分2 主要反映了原儿茶酸的信息；主成分3 主要反映了6、10 号峰的信息。通过成分得分系数矩阵计算综合得分可以评价药材的整体质量[10-11]，结果见表5。

表3 主成分特征值及方差Tab 3 Analysis of principal components and variance

表4 主成分载荷矩阵Tab 4 Principal components loading matrix

表5 13 批小叶金花草主成分得分、综合得分及排名Tab 5 Factor score，comprehensive score and ranking of principal components in 13 batches of samples

4 讨论

4.1 提取条件和流动相优化

在供试品溶液的制备过程中，考察了提取方式（超声提取、加热回流），提取溶剂（水、甲醇、乙醇），溶剂用量（20、30、40 mL）及提取时间（0.5、1、1.5、2 h）等因素对供试品制备的影响，以HPLC 色谱图共有峰的个数和各峰面积作为评价指标，最终确定了本研究中的制备方法。还考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.4%磷酸溶液体系作为流动相对化合物分离效果的影响，结果以乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时，各共有峰有较好的对称性和分离度。

4.2 分析方法评价

本文对13 批小叶金花草药材的指纹图谱进行分析，其中10 批药材相似度大于0.9，说明大部分样品具有较好的相似性。主成分分析显示，前3 个成分因子的累积方差贡献率达到84.643%，其中，经对照品比对出4、5、8 号共有峰分别为香草酸、咖啡酸和菊苣酸，推断主成分1 主要反映了其中酚酸类成分的信息，其方差贡献率达到45.397%，是影响质量的主要因素，这些酚酸类成分都是药材发挥功能主治的基础[12-15]，提示以菊苣酸为代表的酚酸类成分对小叶金花草药材的质量控制有重要意义。13 批样品可聚类为三类，小叶金花草中主要有效成分含量存在批间差异，可能与不同生长阶段、不同的生长环境有关，其原因有待进一步探究[16]。