麦洼牦牛冷冻精液效果试验

杨 壮，刘晓霞，赵睿骁，陈科宇，李小伟，何小强，王燕文，周凡莉，赵晓东，肖 敏，何明珠，唐 瑞，罗光荣*

（1.四川省龙日种畜场，四川 红原624401；2.四川高原牦牛生态科技开发有限责任公司，四川 红原624401）

麦洼牦牛（BOS MUTUS）主产于四川阿坝州的红原、阿坝及若尔盖县，是川西北地区具有代表性的高原家畜，也是当地主要的生产资料[1-3]。近年来，随着超载过牧、草原退化以及长期近亲繁殖等因素的影响[4]，导致麦洼牦牛的后代生产性能逐渐降低，许多优良的基因资源没有得到很好地挖掘利用，通过有效的保种工作，将繁殖性能高、生产性能好、抗逆性强的麦洼牦牛种质资源保存下来，防止品种资源退化，培育高产牲畜[5]成为必然。

冻精是指运用超低温冷冻技术将动物新鲜精液保存起来，以便于精子使用和保存，是一种优良的遗传资源保存及推广手段[6，7]。精液冷冻技术的研究，使得精子在体外保存时间大大延长，我国从80年代初从国外引进生产冷冻精液的技术和设备，开始研究推广液氮冷冻精液技术。根据冻精制作剂型的不同，相继开发了颗粒冻精和细管冻精两种剂型[8]。与细管冻精相比，在卫生方面，由于颗粒冻精完全裸露在空气和液氮中，易污染、易破损。而细管冻精由于封闭在细管中，其被污染率大大降低。在科学标记方面[9]，颗粒冻精多为几十粒甚至上百粒合装，一旦散失，颗粒上既无包装又无标记，很容易造成品种混杂，而细管冻精每支均有详细标记，杜绝了此类事故的发生。在人工授精操作方面，颗粒冻精在人工授精时需要解冻试管、注射器及相关的消毒物品辅助进行，而细管冻精则省去了解冻液、解冻管、注射器等用具，操作较为简易。在精液质量指标和使用效果上也有研究显示解冻后精子活力和存活时间要显著高于颗粒冻精[10]。精子活力强和存活时间久，说明精子存活率高，相应也会提高母牛受胎率及犊牛生产率，直接与经济效益挂钩。总而言之，从卫生、科学、操作简便、经济等方面分析，细管冻精比颗粒冻精有着明显的优越性。因此，90年代后冷冻精液逐步由颗粒型转向细管型。

目前，对麦洼牦牛冷冻精液相关研究较少，为进一步做好麦洼牦牛优秀种质资源的保种工作，2021年4月，四川省龙日种畜场与四川高原牦牛生态科技开发有限责任公司按照牛冷冻精液国家标准（GB4143-2008）方法开展麦洼牦牛细管冻精质量测评，以期达到国家标准规定，为后期优秀遗传资源保存、开展冻精推广等工作打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 冻精来源

麦洼牦牛冷冻精液于2020年取自四川省龙日种畜场牦牛原种场，通过人工采集所收集，精液采集后加入配平的平衡液后，暂存至-6℃车载冷冻冰箱，运送至都江堰综合科研基地开展细管冻精制作，并保存至-193℃的液氮罐[11]。

1.2 冻精质量检测

1.2.1 精子活力检查

1.2.1.1 主要器材 荧光相差显微镜、恒温水浴锅、5.0 mL试管、载玻片、盖玻片、烘片机、移液枪。

1.2.1.2 检查方法 将冻精置于37℃恒温水浴锅中解冻，取解冻精液20 μL置于载玻片上加盖玻片，玻片置于恒温于38℃的烘片机上，待放置2 min后，置于400倍荧光显微镜下观察活力。每片样观察3个视野，进行精子活力评定。按照国家标准（GB4143-2008）要求，精子活力≥35%（即0.35）即为合格。

精子活力评价值M=n1+n2+n3/3

式中，M为活力；n1为第一视野活力；n2为第二视野活力；n3为第三视野活力。

1.2.2 前进运动精子数检查

1.2.2.1 主要器材 荧光相差显微镜、细胞计数板、移液枪、小试管、计数器、3.0%Nacl溶液。

1.2.2.2 检查方法 用移液枪吸取解冻后的精液20 μL，注入盛有0.98 mL的3.0%Nacl溶液中，混匀，使其稀释成50倍的稀释精液。用移液枪吸取稀释精液20 μL放于细胞计数板中，用盖玻片盖好，使精液自然流入计数室，均匀填充，用400倍荧光相差显微镜镜检。按照国家标准（GB4143-2008）要求，前进运动精子数≥800万个即为合格。

前进运动精子数c=s×m

式中，c为每计量前进运动精子数；单位为个，s为每计量中的精子数，单位为个；m为活力。

1.2.3 精子畸形率检查

1.2.3.1 主要器材 荧光相差显微镜、载玻片、计数器、移液枪、蒸馏水、姬姆萨染液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛、甲醇、甘油。

1.2.3.2 试剂配置 磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氢二钠（NaH2PO4·12H2O）2.25 g；双蒸馏水定容至100 mL。中性福尔马林固定液：40%甲醛HCHO8.0 mL；磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氢二钠（NaH2PO4·12H2O）2.25 g，用浓度为0.89%Nacl50.0 mL溶解后加入8.0 mL中和后的甲醛，再加0.89%Nacl溶液定容至100.0 mL。姬姆萨原液：姬姆萨染液2.0 g；磷酸盐缓冲液3.0 mL；蒸馏水5.0 mL。

1.2.3.3 制片、染色、镜检、抹片 用移液枪取解冻后的精液20 uL，置于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈夹角，将样品均匀的涂布于载玻片上，自然风干，风干时间约为5 min；固定：在已风干的抹片上滴上1.0 mL中性福尔马林固定液，固定10 min后用清水冲去固定液，自然风干；染色：将姬姆萨染液滴于自然风干且固定好的抹片上，进行染色，染色10 min，用清水冲去染液，自然风干待检；镜检：将处理好的抹片置于400倍荧光相差显微镜下进行镜检，每个抹片观察200个以上的精子，进行畸形精子计数。按照国家标准（GB4143-2008）要求，精子畸形率≤18%即为合格。

精子畸形率A=A1/S×100%

式中，A为精子畸形率；A1为畸形精子数，单位为个，S为精子总数，单位为个。

1.2.4 细菌数的检查

1.2.4.1 主要器材 培养箱、超净工作台、烧杯、玻棒、天平、牛角匙、高压灭菌蒸汽锅、培养皿、水浴箱、pH试纸（pH5.5～9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、纱布、放大镜、牛肉浸膏、蛋白胨、磷酸氢二钾、Nacl、琼脂粉、1 moL/L氢氧化钠、1 moL/L盐酸、蒸馏水。

1.2.4.2 培养基的配置 胰蛋白胨10 g；酵母粉5 g；氯化钠10 g；琼脂粉30 g。用1 L蒸馏水定容，调节pH值至7.2～7.4范围内，然后分装于三角烧瓶中高压灭菌（121℃灭菌20～30 min）[12]。

1.2.4.3 检查方法 细管冷冻精液置于37℃恒温水浴锅中解冻，用酒精棉球消毒以无菌操作，一支直接注于一个灭菌平板中；把冷却至50℃左右的普通琼脂以无菌操作倾倒入平板中，每个平板约15 mL，倒入平板时，转动平板使精液均匀混合。待琼脂凝固后反转平板，置于37℃培养箱中培养24 h取出，计数平板中的菌落个数。按照国家标准（GB4143-2008）要求，细菌数≤800个即为合格。

细菌数=每个平板中的细菌总数，不做细菌类别区分。

2 结果与分析

通过国家标准方法检测观察冻精样品后，结果详见图1和表1。

图1 麦洼牦牛细管冻精样品

冷冻精液在37℃解冻后4 h内，通过镜检活力仍能达到35%以上（表1）；冷冻精液经过稀释后，通过镜检精子密度较高；通过镜检，发现精子呈现出多种畸形状态，出现尾部弯曲、头尾折叠的畸形较多；从细菌培养结果看，精液内的细菌含量较少，细菌数远远低于国家标准要求。试验结果可以看出，随机抽取的15支牦牛冻精经过检测均达到国家标准（GB4143-2008）要求。

表1 麦洼牦牛细管冻精质量检测结果

3 讨 论

精子是生命延续的基础条件，运用优质的精液于生产实践中，能够加快畜禽品种改良、调整地区畜禽结构及丰富物种多样性，冷冻精液保存正是优秀种质资源得以延续的重要载体。在牦牛本品种改良工作中，运用牦牛细管冻精，能加快本地生产性能较为落后的弱母畜品种复壮，缩短牦牛饲喂周期、提升牦牛生产性能，提高养殖牧户的经济效益[13]。

对公牛精液质量的要求与母牛受胎率有着密切的关系，而“活力”则常被作为评价精液质量的首要指标。在不同时间段不同品种公牛精子活力的比较研究中发现[14]，不管是保存时间中表现的活力，还是精子存活力指数的评价，牦牛始终保持着强势，特别是在14 h仍保持在18%的活力，显著高于其他各品种牛。从抗逆性方面看，生活在高寒低温环境中的牦牛，常年的风土驯化使其产生了良好的适应性，其公牛精子在生存能力上也表现出较强的适应性和存活力。我们的试验结果表明（表1），所有样品的精子活力均能达到35%以上，甚至部分达到80～90%，也同样验证了这一观点。

除精子活力外，牦牛冷冻精液前进运动精子数也是评价冻精产品质量的关键性指标之一，前进运动精子数不仅与受胎率有关，还关系到优秀种公畜冷冻精液的产量及优秀遗传资源的利用率，在总精子数不变的情况下，有效精子数越多，受精率越高[15，16]。如表1所示，我们的所有实验样品中前进运动精子数均≥800万个，说明正常功能的精子数达到足够数量，精子的受精能力可以得到保证。

与此同时，在牦牛冻精批量生产的过程中,不能只把精子的活力和密度作为精液品质检查的重要指标,而忽视了对畸形精子和细菌数的检查。精子畸形率对母牛的受胎率有很大影响[17，18]，如果活力不够、有效精子数量太低，畸形率和细菌数又太高,那么母牛的受孕率也会大大降低，因此精子畸形率以及细菌数也是保证冻精质量过关的重要指标，而我们的结果显示（表1），精子畸形率以及细菌数远低于国标标准，说明符合国家标准。

此外，为保证试验结果的准确性，在实际操作过程中仍要注意以下几点：一是在冷冻精液的保存中要注意液氮罐的密封性，防止因液氮不足而导致冻精失活；二是在细管冻精解冻后要尽快完成整个流程的质量检测工作，抽样数量一次性不宜抽检过多，以免精子因长期暴露在自然条件下丧失活性降解；三是检验人员对精子活力的判断要客观，要掌握精子不同类型的畸形状态，以免错判；四是在配置培养基时，要注意整个配置流程均为无菌操作，以免细菌落入培养基中，影响检测结果。

总而言之，优秀种质资源的保存不能仅仅依靠优秀种质本身，更多的要运用现代科技的技术手段，在不改变其生活状态的前提下，开展优秀资源的挖掘及保存。冻精技术在畜牧业现代化发展进程中起到不可替代的作用，它在畜禽养殖结构调整、转变养殖模式、畜牧业提质增效等方面具有十分重要的意义。

4 结 论

在精子总数不变的情况下，精子质量越高、活力越好，母畜受精率就越高，繁育出来的种畜质量也就越好[19]。本次试验发现，随机抽测的15支麦洼牦牛细管冻精均符合国家标准（GB4143-2008），由此可以说明我单位生产麦洼牦牛冻精质量良好，可用于优秀种质资源的推广工作中。