杨树腐烂病菌胞外分泌复合体亚基CcExo70的功能*

李雪燕 熊典广 田呈明

(北京林业大学林学院 北京 100083)

杨树(Populus)腐烂病是一种分布广泛、危害严重的世界性杨树枝干病害，其主要病原菌金黄壳囊孢(Cytosporachrysosperma)是一种腐生或弱寄生性真菌，适应能力强、寄主范围广且长期潜伏感染，防治困难(陈洪珠, 2013; 闫腾飞, 2016)。在我国北方，杨树腐烂病每年都会造成严重的经济和生态损失(Adamsetal., 2006; Wangetal., 2015)。目前，有关该病害的病原菌系统学、病害发生周期、流行病学、组织病理学和防控技术等方面已有很多研究(Biggsetal., 1983; Guyonetal., 1996; 李东, 2010; Fanetal., 2013)，而关于杨树腐烂病菌与寄主的分子互作机制却鲜有报道(Suetal., 2018; Yuetal., 2019; Wang, 2020)。

病原菌在侵染过程中释放水解酶、毒素、激素等毒力因子，降低宿主植物的防御能力甚至杀死宿主，从而促进病原菌对宿主细胞的渗透和定殖(Kamounetal., 2006; Guanetal., 2020)。病原菌的这些毒力因子需要通过胞内的囊泡运输系统进行转运及分泌。囊泡运输过程通常包括4个基本步骤： 出芽、转运、锚定和融合(贾美慧等， 2012)，参与这一过程的许多蛋白已经被鉴定出来，如可溶性N-乙基顺丁基酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNAREs)、Sec1/Munc18家族(SM)蛋白、Rab GTPases和胞外分泌复合体(Kinchetal., 2006; Stenmark, 2009)。在细胞骨架动力蛋白将囊泡运送到质膜附近之后，且SNARE复合物形成之前，拴系过程开始发生。一系列的拴系相关蛋白，包括Rab-GTP以及多亚基复合物等均参与囊泡融合，目前对胞外分泌复合体(exocyst)在植物病原菌囊泡融合过程中的功能研究多。胞外分泌复合体是由8个亚基(Sec3、Sce5、Sce6、Sce8、Sce10、Sec15、Exo70和 Sec84)组成的(Lipschutzetal., 2002)，其中Exo70亚基是介导运输囊泡与目的质膜锚定的关键因子。Exo70在植物病原真菌的发育、形态、致病性及细胞壁降解酶的分泌中发挥重要作用(Chenetal., 2015)。灰霉病菌(Botrytiscinerea)BcExo70的缺失导致其在生长、菌核的产生、毒力和细胞壁降解酶的分泌等方面表现出明显的缺陷(Guanetal., 2020)。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)Exo70参与调控胞质效应子分泌到生物营养界面(biotrophic interfacial complex，BIC)的非传统外泌途径，这与通过ER-Golgi途径分泌质外体效应子的机制不同(Giraldoetal., 2013)。

Exo70及其他胞外分泌复合体亚基已经在多种真菌中的研究证明它们在真菌生长、形态和致病性中发挥着重要作用，但在杨树腐烂病菌中还未见Exo70相关的研究报道。本文以杨树腐烂病菌中胞外分泌复合体亚基CcExo70为研究对象，利用分子生物学手段对其在生长发育、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面的功能展开研究，为深入了解杨树腐烂病菌致病机制及抗病育种和新型病害防控策略的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

杨树腐烂病菌野生型菌株(wild type，WT)是由本实验室采集、鉴定并保藏于中国林业微生物菌种保藏中心(保藏号为 CFCC 89981)。本实验室初步完成了该菌株的全基因组测序、组装及基因功能注释(accession number： JAEQMF000000000)。CcExo70的敲除突变体及回补菌株均由本试验获得。

1.2 CcExo70的序列和系统发育分析

根据笔者实验室构建的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Exo70的氨基酸序列在杨树腐烂病菌本地全基因组数据库中进行Blastp分析，获得其同源的CcExo70氨基酸序列。其他真菌物种的Exo70同源序列下载于GenBank数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和JGI数据库(https:∥mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home)。使用ClustalX2.0进行多序列比对(Jeanmouginetal., 1998)，利用MEGA6.0软件构建系统进化树(Tamuraetal., 2013)。

1.3 CcExo70突变体及回补菌株的获得

使用Split-marker的方法对CcExo70基因进行敲除，采用PEG介导的遗传转化法将重组片段导入野生型原生质体中，原生质体再生于含有25 μg·mL-1潮霉素的TB3琼脂培养基，并利用含有35 μg·mL-1潮霉素的PDA进行覆盖筛选(刘玲玲等, 2017)。利用引物External-Exo70for/External-Exo70rev和Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev对生长出来的转化子进行PCR筛选。

利用引物CcExo70Compfor/CcExo70Comprev进行PCR扩增获得包括CcExo70启动子在内的整个编码区作为ΔCcExo70-8的回补片段，将得到的回补片段连同含有编码遗传霉素(G418)抗性基因的T质粒共同转化至ΔCcExo70-8菌株的原生质体中，原生质体再生于含有60 μg·mL-1遗传霉素的TB3琼脂培养基，并利用含有75 μg·mL-1遗传霉素的PDA进行覆盖筛选。利用Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev对生长出来的转化子进行PCR筛选。本文所涉及的引物见表1。

表1 引物序列Tab.1 List of primers

1.4 CcExo70的基本生物学表型测定

1.4.1CcExo70敲除突变体的营养生长及菌丝形态测定 为了分析野生型、突变体及回补菌株营养生长的差异，分别取直径3 mm的各菌株的菌丝块接种于PDA平板上，25 ℃培养2天测量菌落直径(张星耀等, 2007)。每个菌株3次重复，试验重复3次。在载玻片上用PDA琼脂薄层培养各菌株，25 ℃温箱中培养3天后，在显微镜下观察菌丝形态并统计单根菌丝的分枝数，每个菌株3次重复，试验重复3次。

1.4.2CcExo70敲除突变体对H2O2耐受性测定 为了检测不同菌株的氧化应激反应(Yuetal., 2019)，将分生孢子座碾碎，用2 mL无菌去离子水洗涤获得分生孢子悬浮液。将106·mL-1的分生孢子悬浮液与PDA混合后，倒入培养皿中。将灭菌滤纸置于培养皿的中央，分别将10 μL 2 mol·L-1和 3.5 mol·L-1H2O2滴加在滤纸上，25 ℃培养2天后测定抑菌圈的直径。每个菌株3次重复，试验重复3次。

1.4.3 致病性测定 于北京林业大学苗圃采集1年生的健康欧美杨(Populus×euramericana)扦插枝条，将枝条剪成25 cm的小段，用蒸馏水冲洗，后用1%次氯酸钠消毒，并用无菌水冲洗3次，石蜡密封枝条顶端防止水分流失。然后用直径5 mm的圆铁加热后将每根嫩枝段烫伤，用打孔器从生长活跃的菌落边缘获取直径5 mm的菌丝块接种于伤口处，用保鲜膜缠绕固定，将接种后的枝条一端浸入水中并覆盖保鲜膜保湿，于室温下培养，定时喷水。发病后测量病斑面积并拍照。所有试验重复3次，每次每个菌株处理至少25根细枝(Yuetal., 2018)。

1.4.4 菌丝染色观察 几丁质沉积染色试验参考Harris等(1994)的方法，在载玻片上用PDA琼脂薄层培养菌株，25 ℃温箱中培养3天后，用10 mg·mL-1的荧光增白剂(calcofluor white，CFW)对菌丝进行染色，于荧光显微镜下观察几丁质的分布。菌丝活性氧积累染色试验参考Song等(2010)的方法，将2 mg·mL-1二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)滴加到菌丝上24 h后观察菌丝中活性氧(ROS)的积累情况。内吞作用参考Fischer-Parton等(2010)的染色方法，在生长于载玻片琼脂薄层上的菌丝中滴加10 μL 5 μmol·L-1FM4-64水溶液，染色相应时间后，立即置于激光共聚焦显微镜(激发光波长514 nm，发射光波长550 nm)下观察菌丝染色情况。以上试验中每个菌株3次重复，试验重复3次。

1.5 蛋白质样品的提取及测序

为了研究CcExo70对胞外分泌蛋白的调控作用，将野生型和ΔCcExo70突变体在添加了灭菌杨树枝条作为诱导的PDB培养基中培养14天。分别收集菌体的培养物及其培养滤液提取蛋白(王爽等, 2012; 胡彬彬等, 2013)。采用Bradford 法测定提取的蛋白浓度(Bradford, 1976)。

取100 μg各样品的蛋白，使用胰蛋白酶在37 ℃条件下过夜酶切，胰蛋白酶处理后的样品利用同位素标记的相对和绝对定量(iTRAQ 8 Plex)结合液相色谱和质谱串联(LC-MS/MS)的蛋白质组学定量分析技术，对蛋白组进行对比分析(Wieseetal., 2007; Unwinetal., 2010)。

1.6 数据分析

使用SPSS对野生型、CcExo70敲除突变体、互补菌株的生长速率、菌丝分枝数量、H2O2胁迫下的抑菌圈大小、病斑面积、菌丝隔膜数量等试验数据进行多重比较分析(Pallant, 2013)，显著性差异水平设定为0.05，当P≤0.05时对比间差异显著。

2 结果与分析

2.1 CcExo70的鉴定和系统发育分析

以酿酒酵母Exo70(CAA89380.1)的蛋白序列为基序，从杨树腐烂病菌全基因组数据库中获得一个同源基因，通过序列分析发现该同源基因含有典型的Exo70结构域，因此命名为CcExo70(ID:MT803485)。该基因全长为1 992 bp，包含1个内含子，编码636个氨基酸。在NCBI和JGI数据库中也获得不同真菌和典型模式生物的Exo70同源基因。分析发现在所有选择的尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、酿酒酵母、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)等真菌及典型模式生物人类(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中只找到1个Exo70同源基因，而在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果杨(Populustrichocarpa)和水稻(Oryzasativa)中发现了数十个Exo70同源基因。此外，在所选的致病卵菌中未能鉴定到Exo70的同源基因。通过对所选病原真菌Exo70同源基因、人类HsExo70、黑腹果蝇DmExo70和小鼠MmExo70进行系统发育和序列比对分析表明，CcExo70与其他病原真菌Exo70同源基因具有较高的序列相似性(VM1G_04257相似度94.9%，VP1G_07527相似度95.1%，MGG_01760相似度62.8%，BcExo70相似度53.9%和SS1G_13345相似度55.2%)，然而其与模式物种酿酒酵母ScExo70(19.1%)、人类HsExo70(14%)和小鼠MmExo70(14.8%)的序列相似性较低(图1)。

图1 Exo70的系统发育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of Exo70 homologs from different organisms

2.2 CcExo70敲除突变体和回补菌株的获得及验证

采用Split-maker的方法对目的基因进行敲除(Goswami, 2012)，敲除突变体及回补菌株获得策略见图2A。通过PCR扩增方法，利用目标基因内部引物Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev在野生型基因组中能扩增出单一的目的条带，突变体中扩增不出目的条带； 采用目标基因外部引物External-Exo70for/External-Exo70rev在突变体中能扩增出单一的条带且大小与替换后的片段大小相近，而野生型中扩增出的片段大小不变(图2B)，证明成功获得CcExo70敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9)。为了验证突变体的表型是否由CcExo70引起，从基因组DNA中扩增出一个包含自身启动子和CcExo70编码区的片段，并将其转化到ΔCcExo70-8原生质体中，通过PCR验证成功扩增出条带，表明成功获得回补菌株(ΔCcExo70/C)(图2B)。

图2 CcExo70敲除突变体及回补菌株的获得Fig. 2 Targeted gene deletion and complementationA： 突变体及回补菌株构建策略；B： 利用特异性引物对得到的转化菌株进行PCR验证。Primer 1： 目标基因外部引物External-Exo70for/External-Exo70rev，M： 1 000 marker; Primer 2： 目标基因内部引物Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev，M： 250 marker。A： Construction strategy of mutants and complementary strain； B： Specific primers were used to verify the transformed strains by PCR. Primer 1: External primer for target gene External-Exo70for/External-Exo70rev, M： 1 000 marker;Primer 2: Target gene internal primer Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev, M： 250 marker.

2.3 CcExo70参与调控菌丝生长发育和胁迫应答

野生型、突变体和回补菌株在PDA平板上培养结果显示，CcExo70敲除突变体的菌落直径显著小于野生型和回补菌株(图3A，C)。同时，在PDB中培养7天后，CcExo70敲除突变体与野生型和回补菌株相比，其生长也显著减慢(图3B)。

图3 CcExo70敲除突变体径向生长Fig. 3 Radial growth in CcExo70 deletion mutantA： 野生型、突变株和回补菌株在PDA平板上生长2天和7天后的菌落形态；B： 菌株在液体PDB中生长7天后的菌丝形态；C： 菌株在培养基上生长2天后菌落直径的统计分析。误差线采用的是标准偏差； 小写字母不同者表示在0.05水平上差异显著。A： Colony morphologies of the wild-type, mutant, and complemented strains after 2 and 7 days of growth on PDA plates; B： The mycelia morphology of the strains after 7 d of growth in liquid PDB; C. Statistical analysis of colony diameters of the indicated strains after 2 d on media. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

CcExo70敲除突变体在单个菌丝上分枝数量明显多于野生型和回补菌株(图4)。

图4 CcExo70敲除突变体的菌丝形态Fig. 4 Mycelium morphology of CcExo70 deletion mutantA： 在含PDA斜面的载玻片上25 ℃培养3天，显微镜下观察菌丝形态； B： 显微镜下计数单个菌丝分枝。误差线采用的是标准偏差； 小写字母不同者表示在0.05水平上差异显著。A： The strain was cultured at 25 ℃ on a slide containing PDA ramp for 3 days, then the mycelia morphology was observed under microscope; B： The number of single mycelium branches was counted under microscope. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

ΔCcExo70突变体菌株对氧化胁迫的反应结果显示，与野生型和回补菌株相比，菌落直径生长量在H2O2胁迫下受到明显抑制(图5)。

上述结果表明CcExo70参与了杨树腐烂病菌的生长、菌丝形态的发生、胁迫的应答。

2.4 CcExo70参与调控杨树腐烂病菌的致病性

CcExo70敲除突变体对寄主植物致病性测定结果显示，接种野生型和回补菌株的枝条3天后均出现明显的病斑(图6A)，但接种CcExo70敲除突变体的枝条病斑面积显著小于接种野生型和回补菌株的枝条。7天后，接种野生型和回补菌株的枝条病斑面积较接种3天时的病斑面积显著增大，而接种CcExo70敲除突变体的枝条病斑面积无显著差异(图6B)。以上结果表明敲除CcExo70会显著降低杨树腐烂病菌对杨树枝条的致病力。

2.5 CcExo70的缺失导致杨树腐烂病菌ROS水平下降

由于CcExo70的缺失导致菌丝生长和致病性的缺陷，使用DAB对杨树腐烂病菌进行染色，24 h后观察细胞内ROS的积累情况，结果显示野生型和互补菌株在菌丝体内能够检测到明显的ROS积累，而CcExo70敲除突变体菌丝体内仅检测到少量的ROS积累，这表明CcExo70敲除突变体菌丝生长过程中产生的活性氧明显低于野生型和回补菌株(图7)，说明CcExo70基因的缺失导致了杨树腐烂病菌中ROS水平的下降。

图7 超氧化物生成检测Fig. 7 Detection of superoxide productionA： DAB染色法检测超氧化物的产生。DAB染色后野生型显示了较深的颜色，表明ROS积累较高，而突变体显示了较浅的颜色，表明ROS积累减少。回补菌株表现出与野生型相似的深色。B： 在DAB染色2天后单根菌丝中ROS积累情况。所有菌株在PDA平板上 25 ℃培养2天，DAB染色后在显微镜下观察。A： Detection of superoxide production by DAB staining. Dark DAB dye in wild type strain suggested a high ROS level, while the mutant showed less color, indicating a reduced ROS accumulation. The reconstituted strain exhibited a darker color similar to wild type. B： Accumulation of ROS in single hyphae after two days of DAB staining. All strains were cultured on PDA plate at 25 ℃ for 2 days, then observed under light microscope after DAB staining.

2.6 CcExo70调控菌丝中几丁质的分布及内吞作用

与野生型和回补菌株相比，CcExo70敲除突变体几丁质沉积存在明显缺陷(图8A)。野生型和回补菌株的菌丝尖端有明显的几丁质沉积，而CcExo70敲除突变体的菌丝尖端几乎没有几丁质沉积的现象(图8B)。然而，在CcExo70敲除突变体的菌丝中发现了比野生型和回补菌株更为密集的隔膜分布(图8C, D)。以上结果说明CcExo70参与了杨树腐烂病菌菌丝中几丁质的分布。

图8 CcExo70敲除突变体中几丁质的分布Fig. 8 Distribution of chitin in the CcExo70 deletion mutantA： 用钙荧光白(CFW)对WT、ΔCcExo70和ΔCcExo70/C菌株的菌丝进行染色，观察几丁质的积累情况。B： 荧光显微镜下单根菌丝尖端几丁质沉积情况。与野生型和回补菌株相比，敲除突变体菌丝顶端没有明显的几丁质沉积。C： 荧光显微镜下单根菌丝隔膜几丁质分布情况。野生型和回补菌株的隔膜分布明显少于突变体菌株。D： 野生型、突变体和回补菌株单根菌丝的隔膜数统计。误差线采用的是标准偏差； 小写字母不同者表示在0.05水平上差异显著。A： Mycelium of WT, ΔCcExo70 and the ΔCcExo70/C strains were stained by calcofluor white(CFW) to observe chitin accumulation. B： Chitin deposition at the tip of mycelia.Compared with the wild type and complementary strains, there was no obvious chitin deposition at the tip of the mutant hyphae.C： After CFW staining, the septal distribution of wild type and complementary strains was significantly less than that of mutant strains under fluorescence microscope. D： The number of septa in mycelium cytoplasm of wild type, ΔCcExo70 and complementary strains. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

通过激光共聚焦显微镜观察发现，FM4-64染色1 min后，可以在野生型和回补菌株的细胞内膜内观察到FM4-64的荧光信号。CcExo70敲除突变体染色1 min后，仅在细胞膜上能够观察到荧光信号； 染色5 min后，可以在CcExo70敲除突变体菌丝内膜中观察到FM4-64的荧光信号(图9)。以上结果表明敲除CcExo70会延迟杨树腐烂病菌的内吞作用。

图9 CcExo70敲除突变体中囊泡的分布Fig. 9 Distribution of vesicles in the CcExo70 deletion mutant菌丝培养3天后用5 μmol·L-1的FM4-64对菌落沙银菌丝体染色进行共聚焦成像。The mycelium were stained with 5 μmol·L-1 FM4-64 for confocal imaging after cultured for 3 days.

2.7 CcExo70参与水解酶及候选效应分子的外泌过程

对WT菌株和ΔCcExo70敲除突变体的细胞培养物和胞外培养滤液进行蛋白组测序分析，在所有样本中共鉴定到284个蛋白，其中有25个蛋白含有信号肽，有8个蛋白的丰度在ΔCcExo70-F中较WT-F相比下降了50%以上(表2)，功能注释显示其包括2个Heat shock protein 70 family(IPR013126)，1个Peptidase G1(IPR000250)，1个Lactonase, 7-bladed beta propeller(IPR019405)，1个Protein disulphide isomerase(IPR005792)，1个L-lysine 6-monooxygenase/L-ornithine 5-monooxygenase(IPR025700)，1个Glycoside hydrolase family 31(IPR000322)，1个Alpha-L-arabinofuranosidase B。

表2 ΔCcExo70-F与WT-F中蛋白质丰度比值Tab.2 List of proteins with abundances fall by over half in ΔCcExo70-F compared to WT-F

进一步分析发现，糖类分解蛋白和蛋白CcSP2、CcSP3、CcSP6和CcSP7在胞外培养滤液中的含量显著高于细胞内，表明这些蛋白很可能作用于胞外。通过生物信息学分析发现，肽酶蛋白CcSP2符合典型效应分子的特征，包括氨基酸序列较小(≤300 aa)、含有信号肽、富含半胱氨酸残基、不含跨膜结构域等。通过LOCALIZER软件对CcSP2进行亚细胞定位预测发现，CcSP2定位于植物线粒体的概率为99.8%。另外，在植物与病原物互作数据库PHI-base中未发现CcSP2同源蛋白的研究报道。CcSP3是一个假定蛋白含有一个内酯酶的结构域，而CcSP6(糖苷水解酶31家族)和CcSP7(α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B)通过参与糖苷的水解代谢过程，从而调控病原菌的致病过程，说明CcExo70参与调控了杨树腐烂病菌候选效应分子和水解酶的外泌。

3 讨论

真核细胞通过胞外分泌调控系统，在特定的位置和时间条件下，将所选的“货物”运输到质膜或细胞外空间调控许多生理过程，如极性生长、形态发生、植物共生及病原微生物与宿主植物的相互作用(Hückelhoven, 2007; Heideretal., 2012; Liuetal., 2012)。作为多亚基栓系复合体家族的一员，胞外分泌复合体在胞吐过程中起着重要作用(Chenetal., 2011; Rivera-Molinaetal., 2013; Shenetal., 2013)。Exo70为胞外分泌复合体中的一员，在病原真菌中研究较少，其在与菌丝生长和致病性相关的胞外和胞内分子运输等生物学过程中的作用机制尚不清楚。本研究在杨树腐烂病菌中鉴定了一个胞外分泌复合体亚基CcExo70，对其功能分析发现CcExo70的缺失导致杨树腐烂病菌生长发育、几丁质分布和毒力出现明显的缺陷。

大多数胞外分泌复合体亚基都参与调控真菌的生长及形态(Lipschutzetal., 2002; Guptaetal., 2015; Guanetal., 2020)。例如，敲除白色念珠菌的Sec3基因，其菌丝的生长显著降低，同时造成菌丝形态异常(Lietal., 2007)，且使囊泡不能够栓系和锚定在菌丝尖端的生长点位置； 酵母中胞外分泌复合体2个亚基Sec3和Exo70会形成亚复合体结合在质膜上，促进分泌囊泡与目标区域的质膜进行栓系和锚定，从而调控酵母的出芽生长(Bendezúetal., 2012)； 敲除灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)BcExo70会显著降低该病菌的生长速率； 且菌丝内的囊泡并不会显著的聚集于菌丝的尖端生长点，而主要分布于菌丝胞质内(Guanetal., 2020)。在真菌中，将分泌囊泡转运至菌丝尖端富含囊泡的顶体区域(Spitzenkörper, 2007)对于维持菌丝的生长和正常形态具有重要的意义(Riquelmeetal., 2014)。在本研究中，笔者发现敲除CcExo70同样会造成杨树腐烂病菌生长显著降低，使用FM4-64染色发现，敲除CcExo70会延迟菌体的内吞作用，同时也会影响菌丝内囊泡的分布，原本会在菌丝尖端生长点聚集的几丁质消失了，但菌丝内的隔膜数量显著增多。此外，与野生型和回补菌株相比，CcExo70敲除突变体的菌丝形成了更多的分枝。因此，推测敲除Exo70后，含有调控菌丝生长相关的酶和其他材料的囊泡不能够正常转运至菌丝尖端而导致菌丝生长和形态缺陷。与上述功能相对应的是，胞外分泌复合体不同亚基在菌丝的尖端生长点都存在明显的聚集(Chenetal., 2015; Guptaetal., 2015)。

CcExo70调控杨树腐烂病菌候选效应分子和水解酶的分泌及致病过程。病原菌向胞外分泌各类水解酶、毒素以及效应分子是其非常重要的一类致病策略，胞外分泌复合体通过调控病原物的这一过程，从而在一定程度上影响病原菌的致病性。对灰葡萄孢菌BcExo70的研究发现，敲除该基因会显著降低该病菌对寄主植物番茄(Lycopersiconesculentum)的致病力； 灰葡萄孢菌致病关键水解酶聚半乳糖醛酸酶的活性在BcExo70敲除突变体胞外培养液中显著降低(Guanetal., 2020)。敲除稻瘟菌Exo70同源基因后不仅显著降低了该病菌的致病力，还会造成分生孢子尖端以及附着胞外围的粘液显著减少，导致病菌对寄主叶片附着能力下降，从而降低其致病性。另外，对稻瘟菌Exo70和Sec5敲除突变体胞外分泌总蛋白进行分析发现，Exo70敲除突变体胞外分泌总蛋白量仅有野生型菌株的1/3左右，Sec5敲除突变体胞外分泌总蛋白量也不到野生型菌株的一半。稻瘟菌的Exo70和Sec5参与调控了该病菌胞质效应分子分泌到BIC界面的过程，从而影响该病菌的致病过程(Giraldoetal., 2013; Guptaetal., 2015)。敲除CcExo70也会显著降低杨树腐烂病菌对杨树枝条的毒力，进一步对野生型和CcExo70敲除突变体的胞内和胞外蛋白进行蛋白质组分析发现，几个候选效应分子和水解酶的分泌依赖于CcExo70。本研究表明，与野生型和回补菌株相比，CcExo70敲除突变体对H2O2胁迫更敏感，并且CcExo70敲除突变体菌丝中ROS积累显著减少，这表明CcExo70在细胞外ROS耐受和细胞内ROS稳态中发挥重要作用，而植物病原物细胞内ROS稳态对于其发挥毒力功能十分关键，细胞内ROS稳态的破坏将导致其功能缺陷(Eganetal., 2007)。在稻瘟菌中还未探究Exo70与ROS的关系，但对另一个胞外分泌复合体亚基Sec6的研究表明，在ROS合成缺陷的NADPH氧化酶类ΔnoxR和Δnox2敲除突变体中，Sec6在附着胞中会出现错误的定位。这表明胞外分泌复合体与ROS之间存在一定的关联，但它们之间是如何相互作用的还需要进一步探究。上述研究结果表明，不同病原真菌的Exo70同源基因在调控菌丝生长和形态、胞内囊泡转运、毒力物质的分泌及致病性等方面具有保守功能(Guptaetal., 2015; Guanetal., 2020)。

4 结论

本研究通过生物学功能分析，发现CcExo70参与调控真菌生长、内吞作用、胁迫应答反应、水解酶类和候选效应蛋白的分泌，降低病原菌的致病性。