丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡生产性能、肠道形态和菌群的影响

何 菊，李筱雯，崔卫涛，郭 杰，王 纯，肖运才，李自力，周祖涛

（1.华中农业大学动物医学院/湖北省预防兽医学重点实验室，武汉 430070；2.湖北华大瑞尔科技有限公司/生物发酵饲料湖北省工程研究中心，武汉 430070）

欧盟委员会在2013年批准丁酸梭菌可作为蛋鸡饲料添加剂，中国也于2013年正式将丁酸梭菌纳入新饲料添加剂中［1］。研究报道，在种鸡和肉鸡饲粮中添加丁酸梭菌能有效提高日增重、平均体重、产蛋率和饲料转化率，促进肠道发育和肠道形态的完整，提高肠道有益菌数量，抑制有害菌，可有效预防肠炎的发生［2，3］。作为饲料添加剂，丁酸梭菌既可单独使用也可和其他益生菌复合使用，目前丁酸梭菌单独使用在抗病促生长方面尚难达到与抗生素相同的效果，而与芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等菌种复合及与低聚糖、中草药、维生素和酶制剂等添加剂联合应用显示出优异的成绩［4，5］，因此复合型益生菌添加剂的研究显得非常必要。为此，本试验将丁酸梭菌CB1单菌制剂及其与枯草芽孢杆菌复合菌制剂添加于肉鸡日粮中，评价丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡生产性能、肠道形态和菌群的影响，确定丁酸梭菌CB1制剂的益生效果，为肉鸡日粮中抗生素替代提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品及试验动物

丁酸梭菌CB1制剂（有效活菌数2×109CFU/g）和复合菌制剂（丁酸梭菌CB1有效活菌数2×109CFU/g，枯草芽孢杆菌TL有效活菌数2×1010CFU/g），由湖北华大瑞尔科技有限公司提供。金霉素（含量为15%）购自金河生物科技股份有限公司。试验肉鸡品种为Cobb500，购自湖北荆州正康家禽有限公司。

1.2 试验动物与试验设计

选取1日龄Cobb 500肉鸡15 000只，随机分为5组：A组（基础日粮）、B组（基础日粮+50 g/t金霉素）、C1组（基础日粮+100 g/t丁酸梭菌CB1制剂）、C2组（基础日粮+200 g/t丁酸梭菌CB1制剂）、D组（基础日粮+200 g/t复合菌制剂），每组3个重复，每个重复1 000只。基础日粮为玉米豆粕型日粮，参照NRC（1994）营养需要配制，试验周期为42 d。饲喂试验在湖北当阳正阳家禽养殖专业合作社开展，同一栋鸡舍，网上平养，免疫按常规程序进行。

1.3 生产性能测定方法

生产性能指标包括平均日增重、料肉比和死亡率。试验期间每天记录采食量和鸡群数量，分别在1、7、14、21、28、35、42 d时，每个重复随机抽取100只鸡进行称重，称重在早晨喂料前进行，计算1～21、22～42、1～42 d的平均日增重和死淘率，全程料肉比和死亡率。

1.4 相关指标检测方法

分别在21 d和42 d，每个重复随机抽取10只鸡，称取每只采样鸡活体重量并记录，颈部静脉放血处死，剖开腹腔采集各项检测指标所需样品。

1.4.1 肠道形态检测 用细线结扎盲肠和回肠中上段一端，取长度约2 cm的肠段，于4%甲醛溶液中固定，经洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、修蜡、切片等处理步骤，进行常规HE染色。使用日本Nikon 80i生物光学显微镜并结合NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统进行测量、观察和取图，每张切片观察选出2～3个典型视野，测定10根完整绒毛的绒毛高度（VH）和隐窝深度（CD），计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD）。

1.4.2 肠道菌群q RT-PCR检测目的基因 结扎固定位置和固定长度的回肠、盲肠，置于50 mL灭菌离心管中保存，于无菌超净台中称取肠道内容物。为减少个体差异所带来的试验偏差，将每组采集的粪便样品混合。以乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌、大肠杆菌和沙门氏菌属特异性基因为靶基因构建标准质粒。PCR扩增引物及退火温度见表1。

采用3步法定量检测肠道菌群数量的q PCR，其中，大肠杆菌和沙门氏菌反应程序为：95℃预变性30 s；40个循环，95℃变性5 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s。乳酸杆菌和梭菌反应程序为：95℃预变性30 s；40个循环，95℃变性5 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s。双歧杆菌反应程序为：95℃预变性30 s；40个循环，95℃变性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。反应体系为：SYBR Premix Ex Taq II 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，模板2μL，加去离子水补足至20μL。每次RT-PCR扩增反应结束后，通过用熔解曲线（65～95℃）来检测扩增产物的单一性。

1.5 数据处理

试验数据用SPSS 19.0软件进行统计分析，利用ANOVA、LSD进行差异显著性检验和Duncan多重比较，试验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡生产性能的影响

2.1.1 平均日增重 丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂对肉鸡平均日增重的影响结果见表2。由表2可知，在1～21 d，C2和D组平均日增重均极显著高于A组（P<0.01），D组平均日增重最高（37.74 g/d）；与B组相比，C1、C2和D组平均日增重分别提高了4.76%、6.54%、14.33%。在22～42 d，B组平均日增重极显著高于A、C1、C2和D组（P<0.01）。在1～42 d，与A组相比，B、C1、C2和D组的平均日增重分别提高了5.46%、0.37%、1.52%和4.10%，D组与B组平均日增重基本持平。上述结果显示，丁酸梭菌CB1制剂及其复合菌制剂对肉鸡1～21 d促生长效果优于抗生素组，22～42 d促生长效果低于抗生素组，从全程比较，复合菌制剂促生长效果与抗生素相当。

表2 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡平均日增重的影响（单位：g/d）

2.1.2 料肉比与死亡率 由图1可知，C2、D组料肉比与死亡率均优于A组和B组，说明在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂可以提高饲料转化率和肉鸡存活率。

2.2 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡肠道形态的影响

丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂对肉鸡肠道形态的影响结果见表3和表4。由表3、表4可知，21 d时，B、C1、C2和D组回肠VH/CD值比A组分别提高了1.0%、1.51%、7.79%和32.41%。B、C1、C2和D组盲肠VH/CD值比A组分别提高了11.54%、50.00%、65.38%和95.51%。?D组回肠、盲肠VH/CD值均极显著高于C1、C2组。

42 d时，B、C1、C2和D组回肠VH/CD值比A组分别提高了18.34%、19.48%、22.92%和47.56%，D组VH/CD值与B、C1、C2组相比差异极显著（P<0.01）。B、C1、C2和D组盲肠VH/CD值比A组分别提高了31.49%、54.70%、80.11%和95.58%，D组VH/CD值最高。上述结果表明，日粮中添加丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂可提高肉鸡回肠、盲肠绒毛高度，降低隐窝深度和显著提高绒毛高度与隐窝深度比值，有效改善肠道形态结构。

2.3 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡肠道菌群的影响

丁酸梭菌CB1制剂及其复合菌制剂对肠道菌群的影响结果见表5和表6。由表5、表6可知，在21 d时，回肠中乳酸杆菌数量C1、C2和D组极显著高于A组和B组（P<0.01），B组乳酸杆菌数量最低；双歧杆菌数量C1、C2和D组极显著高于B组（P<0.01）；大肠杆菌数量各处理组均低于A组。盲肠中乳酸杆菌数量C2、D组极显著高于A组和B组（P<0.01）；双歧杆菌数量C1、C2和D组极显著高于A组和B组（P<0.01），与B组相比，分别提高了8.25%、10.77和9.34%；大肠杆菌数量各处理组均低于A组；沙门氏菌数量C2和D组显著低于A组（P<0.05）。添加丁酸梭菌CB1制剂提高了C1、C2和D组回肠、盲肠中梭菌数量。

在42 d时，C1、C2和D组回肠乳酸杆菌、双歧杆菌数量极显著高于B组（P<0.01）；大肠杆菌数量B、C1、C2和D组均极显著低于A组（P<0.01）。盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌数量C1、C2和D均极显著高于A组和B组（P<0.01），双歧杆菌数量B组最少；沙门氏菌数量C1、C2和D组显著低于B组（P<0.05）。上述结果显示，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂提高了回肠、盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌数量，降低了沙门氏菌的数量，高剂量组和复合菌组尤其显著。

3 小结与讨论

3.1 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡生产性能的影响

丁酸梭菌能够促进机体对营养物质的消化吸收，提高肉鸡生产性能。杜云平等［11］研究表明，日粮中添加丁酸梭菌可明显改善肉鸡日增重、饲料转化率和经济效益，日增重比对照组提高了4.61%，饲料转化率提高9.26%，只均利润提高0.97元。赵旭［12］研究报道，日粮中添加丁酸梭菌显著提升了肉鸡的平均日采食量和日增重（P<0.05）。丁酸梭菌还具有降低脂肪沉积的功能，其主要的代谢产物丁酸发挥重要作用，丁酸梭菌也改变了肉鸡肠道中的菌群结构，从而促进肉鸡的脂肪合成。

表5 丁酸梭菌CB1制剂对21 d肉鸡肠道菌群数量的影响 ［单位：log（copies/g）］

表6 丁酸梭菌CB1对42 d肉鸡肠道菌群数量的影响 ［单位：log（copies/g）］

本研究中，肉鸡日粮中添加丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂能够改善肉鸡生产性能，有效降低料肉比和死亡率。在1～21 d，丁酸梭菌CB1制剂添加组C1、C2和D组的平均体重显著高于抗生素组（P<0.05或P<0.01），但22～42 d的平均体重极显著低于抗生素组（P<0.01）。其原因可能是在生长前期，肉鸡肠道菌群不完善，外源添加丁酸梭菌CB1及其复合菌制剂迅速促进了肠道菌群的建立及维持稳态，促进机体的生长，其作用优于抗生素。在21 d后，肠道菌群变化逐渐趋于稳定，丁酸梭菌CB1制剂对菌群丰度的影响作用趋低，而抗生素调整菌群丰度作用趋高，其作用优于丁酸梭菌CB1制剂。龚琪等［13］研究发现，雏鸡盲肠菌群从7～14日龄为一个过渡期，从14～42日龄为相对稳定期，益生菌或抗生素的添加可以促进肠道菌群在过渡期更有效地完成过渡，在稳定期维持更稳定的状态。经试验全期分析，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌CB1与枯草芽孢杆菌TL复合菌制剂（200 g/t），其促生长效果与金霉素组相当，能替代抗生素类药物，起到抗病促生长的作用。

3.2 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡肠道形态的影响

肠道是营养物质消化和吸收的主要部位，肠道功能与肠绒毛高度（VH）和隐窝深度（CD）密切相关。VH/CD比值升高，说明肠道形态功能得以增强，消化吸收功能提高。刘来亭等［14］报道，添加0.6%、0.9%酪酸芽孢杆菌可显著提高肉鸡小肠绒毛高度（P<0.05）。日粮中添加不同剂量的丁酸梭菌，与对照组相比，显著提高了肉鸡14、21和42 d回肠绒毛高度，降低了隐窝深度（P<0.05）；肉仔鸡饲喂益生菌饲料添加剂后，小肠黏膜皱襞增多，绒毛高度增高，小肠吸收面积增大［15］。本研究中，添加丁酸梭菌CB1制剂后能有效促进肠道形态的生长发育，显著提高21、42 d肉鸡盲肠和回肠VH/CD值，丁酸梭菌CB1复合菌制剂对肠道形态的改善优于抗生素。

3.3 丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡肠道菌群的影响

动物肠道内复杂的微生物菌群对营养吸收和健康起着重要作用。丁酸梭菌为厌氧芽孢杆菌，能产生丁酸、乙酸和丙酸，促进双歧杆菌、乳酸杆菌等肠道有益菌群增殖，抑制大肠杆菌、伤寒沙门氏菌等致病菌和腐败菌的生长，促进肠道微生物菌群平衡，降低有害物质的产生。丁酸梭菌能够促进有益微生物的生长而减少有害菌的增殖，具有调控肠道内微生物群落结构平衡、优化宿主肠道内微生态环境的功能［16，17］。

本研究中，日粮中添加丁酸梭菌CB1制剂对肉鸡肠道回肠和盲肠双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖有显著的促进作用。在21和42 d，丁酸梭菌CB1制剂添加组C1、C2和D组回肠和盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌数量极显著增加（P<0.01），高于A组和抗生素B组，大肠杆菌、沙门氏菌数量有降低的趋势。在试验中，随着日龄的增加，肠道内容物中有益菌逐渐增加，有害菌不断减少，说明丁酸梭菌CB1制剂在促进有益菌繁殖和维持肠道菌群平衡方面具有优势。