低磷胁迫对烤烟根系有机酸含量及土壤磷酸酶活性的影响

肖如武，黄楚龙，宗钊辉，王 维，赵伟才，王 军

（1.广东中烟工业责任有限公司，广东 广州 510599；2.深圳烟草工业责任有限公司，广东 深圳 518109；3.广东省烟草南雄科学研究所/广东省烟草育种与综合利用工程技术研究中心，广东 韶关 512400；4.华南农业大学农学院，广东 广州 510642）

【研究意义】磷是烟草生长发育必需营养元素之一，是核酸、核苷酸、磷脂等物质的重要组成元素，参与烤烟光合作用与呼吸作用，对烤烟体内糖、蛋白质、脂肪的代谢具有重要的调控作用［1-2］。土壤有效磷含量低时，烤烟蛋白质合成受阻，代谢活动紊乱，表现为生长缓慢，植株矮小，调制后烟叶油分少，显著影响烟叶产质量［3-4］。我国主要烟区土壤全磷含量在0.3～2.5 g/kg之间，能被烤烟直接吸收的有效磷占比不到5%［5-8］，不能满足烤烟正常生长发育所需。生产上主要通过外施磷肥来解决土壤有效磷缺乏的问题，但由于土壤的固化与肥料的流失，磷肥利用率不到25%。为了提高产量，往往过量施用磷肥，加速了磷矿资源的枯竭，土壤磷素盈余越来越多，磷素流失的同时也引起水体富营养化的生态问题。因此，探讨烟叶生产中磷素缺乏对烤烟根系有机酸含量与土壤磷酸酶活性的影响，对指导烟叶生产磷素施用具有重要意义。

【前人研究进展】根系是作物与土壤互作的器官，低磷胁迫下，根系合成与分泌根系分泌物能力加强，同时作物通过感受根系分泌物浓度的变化，反馈调节作物地下部与地上部的生长［9-10］。前人研究发现紫云英［11］、大豆［12］、坚果［13］等根系分泌物能有效活化土壤难溶性无机磷与有机磷，提高土壤与根际磷酸根离子含量进而促进植物对土壤磷素的吸收利用。有机酸是根系分泌物的主要成分，章爱群［14］进行有机酸对土壤难溶性无机磷的活化研究，发现有机酸含量与土壤难溶性无机磷活化效果以及磷酸根离子含量呈正相关，通过与难溶性磷酸盐胶体中的正价金属离子螯合，同时有机酸中的H+能酸化根际土壤，提高难容性磷酸盐的溶解度，释放磷酸根从而改善作物磷素营养。肖晓明等［15］研究发现澳洲坚果在减少50%正常施磷量条件下生长良好，主要原因是澳洲坚果的排根能分泌大量的酸性磷酸酶，通过活化外源dNTP、DNA、ADP和6-磷酸果糖等有机磷，释放出磷酸根离子，实现对土壤磷营养的改良。沈宏等［16］在对不同作物低磷胁迫下的自我调节机制研究表明，在低磷胁迫下，作物通过提高根冠比、增加次生根数量、刺激根毛生长提高根系有机酸合成能力与酸性磷酸酶活性，适应低磷胁迫，提高磷肥利用率。可见，在低磷胁迫时，作物通过调节根系分泌物的合成和释放，活化土壤难溶性无机磷与有机磷，提高磷素利用率。

【本研究切人点】当前部分作物（水稻、小麦、大豆等）在低磷胁迫下，对土壤难溶性磷活化、吸收机理研究已有相关报道。而关于烤烟低磷胁迫下，烤烟根系分泌物对土壤磷素的活化利用研究鲜有报道，因此开展低磷胁迫对烤烟根系分泌物与磷素利用研究十分必要。【拟解决的关键问题】通过设置3个不同施磷水平，测定烤烟根系分泌的有机酸种类与磷酸酶活性，探索其与土壤难溶性磷的关系，为后续生产磷肥施用提高科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年在华南农业大学农场进行盆栽试验，盆高34.5 cm，上口径37.5 cm，底径28.5 cm，盆栽用土取自华南农业大学农场试验田0～20 cm耕作层土壤，田土晒干、敲碎，捡去杂物，过筛，每盆装土20 kg。土壤类型为砂泥田土，土壤有机质2.87%、全氮1.73 g/kg、全磷0.44 g/kg、全钾28.43 g/kg，速效氮89.32 mg/kg、速效磷18.37 mg/kg、速效钾124.65 mg/kg。

供试烤烟品种为云烟87。

1.2 试验方法

试验设置3种不同施磷水平，用量分别为0 g/株（P1）、4 g/株（P2）、8 g/株（P3），各处理N施用量均为8 g/株，K2O施用量为20 g/株，氮、磷、钾肥采用分析纯硝酸铵、磷酸二氢钠和硫酸钾。每个处理20盆/株，按行距1.2 m、株距0.6 m进行摆盆，各处理随机区组排列，避免因光照、通风等环境因素造成误差。采用湿润育苗的方法进行育苗，4叶1心时进行移栽，定时滴灌装置补充水分，每天16：00～20：00进行浇水，滴灌速度0.5 L/h，根据天气与烤烟水分需求，适当提高或降低滴灌速度，确保土壤全部浸湿。在盆底放置底座，避免烤烟根系扎入土。其他农事操作与病虫害管理参考优质烟叶生产管理要求进行。

在烤烟移栽后25、40、55、70、85 d测定土壤全磷与速效磷含量。在团棵期、旺长中期、现蕾期取样，测定根系有机酸分泌物含量、烤烟磷含量与磷浓度，同时测定土壤磷酸酶活性。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 土壤理化特性 土壤理化性质的测定均参照《土壤农化分析》（鲍士旦，2013）中的有关方法。在烤烟移栽后25、40、55、70、85 d取盆栽土壤样品，土壤全磷用氢氧化钠熔融—钼锑抗比色法测定，土壤有效磷用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定。土壤磷素表观盈余量（g/株）＝施磷量－植株吸磷量。

1.3.2 根系有机酸组成与含量 准备直径5 mm的层析滤纸片若干，用甲醇清洗3次，再用重蒸水清洗3次，在无菌条件下晒干备用。挑选3株生长一致的烤烟从盆钵中取出、洗净泥士，将根系在去离子水中清洗数次，以除去表面的营养养分，然后将根系平放于铺有湿滤纸的瓷盘中，在每个植株上选取生长相近的5～10个二级侧根的根尖收集部位，在有机酸收集部位（根尖）的下方垫上2 cm×2 cm的塑料胶片，然后再在收集部位根组织的上下方各放1个预先处理好的层析滤纸片；其余根段用营养液浸湿的滤纸片覆盖；最后用黑塑料布将整个根系罩住，在光照下收集2 h后，将每个植株不同部位的滤纸片放入2.50 mL Ependorf 管中，每10个滤纸片加300 mL重蒸水放入液氮中保存。测定前将其溶解，12 000 r/min离心10 min，取上清液用以高效液相色谱分析。

1.3.3 土壤磷酸酶活性 土壤磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，分别在酸性（醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.6）、中性（柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH7.0）、碱性（硼酸-硼酸钠缓冲液，pH9）环境中，使用土壤磷酸酶催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过计算24 h后1 g土壤中酚的生成量计算其活性。

1.3.4 烤烟磷含量 在下部叶采收前，把烤烟整株挖起用清水洗净，分地上部与根系取样，105℃杀青30 min后，70 ℃烘干至恒重，称取各部分的干重。采用H2SO4-H2O2消煮，钒钼黄比色法测定各部分全磷含量，据此计算烟株的吸磷量。土壤磷素表观盈余量（g/株）＝施磷量－植株吸磷量。

1.3.5 烤烟农艺性状 在烤烟不同时期，按照《烟草农艺性状调查测量方法（YC/T142—2010）》测定成熟期烤烟农艺性状。

2 结果与分析

2.1 施磷水平对土壤全磷和速效磷含量的影响

由图1和图2可知，土壤全磷和速效磷的含量存在差异，各处理速效磷含量在烤烟移栽40 d后达到最大值，P1、P2、P3处理分别为20.12、27.38、30.39 mg/kg，之后随着烤烟生育进程的推进逐渐下降，烤烟生长后期P1处理的土壤有效磷降幅变小，说明烤烟能自发调节适应低磷胁迫，加强对土壤磷素的活化与利用，提高根系利用土壤磷的能力。各处理土壤全磷含量变化趋势一致，均随着烤烟生育进程呈下降趋势，其中P3处理的土壤全磷含量高于P2、P1处理，至烤烟移栽后85 d比移栽后25 d 减少0.1 g/kg，土壤全磷减少量比P1、P2处理增加。由图3可知，磷素表观盈余量随施磷量的增加逐渐增大，由磷亏缺转变成磷盈余，其中P3处理每株土壤磷盈余量为6.40 g，而P1处理的土壤磷素盈余量为负值，说明不施磷处理下的土壤磷素处于亏缺状态。

图1 施磷水平对土壤全磷含量的影响Fig.1 Effects of phosphorus application levels on soil total phosphorus content

图2 施磷水平对土壤速效磷含量的影响Fig.2 Effects of phosphorus application levels on soil available phosphorus content

图3 施磷水平对土壤磷盈余量的影响Fig.3 Effects of phosphorus application levels on soil phosphoric acid surplus

2.2 施磷水平对烤烟根系分泌有机酸含量的影响

不同施磷水平处理下，烤烟根系分泌的有机酸种类及含量见表1。由表1可知，烤烟根系分泌的有机酸主要组成为乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸，其中苹果酸的含量最高，在旺长中期达164.26 μg/g。随着烤烟生育期进程，P1、P2处理烤烟根系有机酸含量总量呈先增长后缓慢下降趋势，在旺长中期达最高，分别为220.16、131.63 μg/g，团棵期含量最低；P3处理烤烟根系有机酸含量呈上升趋势，在现蕾期达最高值82.89 μg/g。不同施磷水平对烤烟根系分泌的有机酸含量影响显著，在烤烟团棵期、旺长中期和现蕾期，P1处理烤烟根系有机酸总量比P3处理分别增加190.79%、240.22%、87.04%。各种有机酸中，不同施磷水平间苹果酸差异最大、达4.43倍；不同施磷水平对柠檬酸、乳酸含量影响主要在旺长中期以后，对乙酸、苹果酸、酒石酸影响主要在现蕾期前，各种有机酸不同施磷水平处理的变化趋势与总量变化趋势相似。

表1 施磷水平对根系分泌有机酸组成及含量（μg/g，FW）的影响Table 1 Effects of phosphorus application levels on the composition and content of organic acids secreted by roots

2.3 施磷水平对烤烟根际土壤磷酸酶活性的影响

土壤磷酸酶是催化含磷有机酯和酐水解的一类酶的总称，它表征了土壤磷的状况，根据酶促反应最适pH值将磷酸酶分为酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和中性磷酸酶。由图4～图6可知，P1、P2处理烤烟不同生育期土壤酸性磷酸酶活性高于中性和碱性磷酸酶活性；P1、P2、P3处理酸性磷酸酶活性均在烤烟旺长中期达到最大值，分别为156.12、118.91、62.76 μg/g·h。不同施磷水平间土壤酸性磷酸酶活性差异显著，P1处理酸性磷酸酶活性在团棵期、旺长中期、现蕾期比P3处理分别高76%、155%、114%。从图5、图6还可发现，不同施磷水平土壤中性磷酸酶活性和碱性磷酸酶活性在烤烟团棵期、旺长中期差异不显著，但在现蕾期，随着施磷水平的增加，土壤中性磷酸酶活性、碱性磷酸酶活性显著下降，与P3处理相比，P1处理土壤中性磷酸酶活性、碱性磷酸酶活性分别高44.56%、72.91%。

图4 施磷水平对根际土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig.4 Effects of phosphorus application levels on acid phosphatase activity in rhizosphere soil

图5 施磷水平对根际土壤中性磷酸酶活性的影响Fig.5 Effects of phosphorus application levels on neutral phosphatase activity in rhizosphere soil

图6 施磷水平对根际土壤碱性磷酸酶活性的影响Fig.6 Effects of phosphorus application levels on alkaline phosphatase activity in rhizosphere soil

2.4 烤烟根系有机酸分泌总量与磷酸酶活性的相关分析

由图7可知，烤烟根系有机酸分泌总量与酸性磷酸活性呈显著正相关、相关系数为0.924，与碱性磷酸酶、中性磷酸酶活性均呈正相关关系，但相关系数均小于0.2，相关性不显著。这说明在缺磷条件下，烤烟有机酸的分泌总量增加能使得土壤酸性磷酸活性增强，进而使土壤速效磷含量得到提高，以此来降低营养胁迫带来的危害，维持烤烟正常生长。

图7 有机酸含量与磷酸酶活性的相关性分析Fig.7 Correlation analysis of organic acid content and phosphatase activity

2.5 施磷水平对成熟期烤烟磷含量和积累量的影响

由图8、图9可知，不同施磷处理烤烟地上部磷浓度、磷积累量均高于根系，随着施磷量增加烤烟地上部与根系磷浓度、磷积累量均显著提高，与磷施用量呈正相关关系。与P1处理相比，P3处理烤烟地上部磷浓度和磷积累量分别提高27.12%、54.10%，根系磷浓度和磷积累量分别提高48.84%、91.89%，根系的磷积累量和磷浓度提高幅度均大于地上部，表明磷素亏缺对根系影响 大于地上部，同时磷积累量变化幅度大于磷浓度，说明烤烟磷浓度小幅变化，对烤烟磷素积累有重要影响。

图8 施磷水平对烤烟地上部和根系磷含量的影响Fig.8 Effects of phosphorus application levels on the phosphorus content in the shoots and roots of tobacco plants

图9 施磷水平对烤烟地上部和根系磷积累量的影响Fig.9 Effects of phosphorus application levels on the phosphorus accumulation in the shoots and roots of tobacco plants

2.6 施磷水平对成熟期烤烟农艺性状及干物质积累量的影响

由表2可知，不施磷肥处理下烤烟均能正常生长发育，这可能与试验土壤有效磷与全磷含量较高有关，其中P3处理烤烟农艺性状及干物质积累量均显著高于P1处理，其地上部干物质积累量和根重分别提高29.6%、28.9%；P2处理烤烟株高、茎围、根重与P1处理差异不显著，但叶片数、最大叶面积以及地上部干物质积累量显著高于P1处理，表明适当施磷有助于烤烟的生长发育。

表2 施磷水平对烤烟地上部和地下部生长发育的影响Table 2 Effects of phosphorus application levels on the growth and development of the shoots and roots of tobacco plants

3 讨论

本研究中，不同施磷水平对于土壤全磷、有效磷含量与磷素盈余量有显著影响，施磷条件下，土壤有效磷含量在短暂上升后呈下降趋势，可能是磷化合物发生络合反应与土壤颗粒对磷酸根离子的吸附固定，导致土壤中的有效磷较少。提高施磷水平，土壤有效磷含量增加，这与前人研究不同施磷对棉花［17］、玉米［18］、黄瓜［19］等作物土壤磷含量影响的结果相似。顾惠敏等［20］研究发现，不同质地棉田土壤有效磷随着施磷量增加而增加，但增加幅度呈下降趋势。付蓉等［21］认为，随着施磷量增加，土壤磷素表观盈余量逐渐增大，由磷亏缺转变成磷盈余，这与本研究结果一致，在生产上当土壤磷元素盈余水平较高时，可以适当降低施磷水平。

前人研究表明，作物根系在感受低磷胁迫时，会诱导并分泌有机酸和磷酸酶等根系分泌物，苹果酸等有机酸和酸性磷酸酶能通过络合反应、降低土壤pH、水解磷化合物等途径，弱化土壤对磷素的固化能力，提高作物对难溶性磷和有机磷的活化利用［22-23］。本研究中，与施磷处理相比，不施磷处理土壤有机酸含量和根际酸性磷酸酶活性显著增加。肖晓明等［15］研究发现缺磷条件下澳洲坚果会大量分泌柠檬酸，兰忠明等［11］研究发现紫云英在缺磷条件下根系分泌的有机酸以草酸为主，由此可见，低磷条件下不同作物根系分泌的有机酸存在差异。本研究发现低磷处理下，烤烟根系分泌的有机酸以苹果酸为主，占有机酸总量50%以上。在不同pH条件下不同种类磷酸酶活性不同，本研究中，低磷处理土壤酸性磷酸酶活性显著高于其他两种磷酸酶活性，且施磷水平越低酸性磷酸酶活性越强，但对碱性磷酸酶和中性磷酸酶活性影响差异不显著。对有机酸含量与根际磷酸酶活性的相关性分析表明，酸性磷酸酶与有机酸含量呈正相关关系，有机酸含量增加，酸性磷酸酶活性加强，与展晓莹等［24］研究结果相似，低磷条件下有机酸含量增加，土壤pH降低，酸性磷酸酶活性增加。在烟叶生产过程中，在磷元素利用水平低的酸性土壤中，可适当外源施入苹果酸、乳酸、乙酸等有机酸，提高烤烟对土壤磷元素的利用率。

烤烟磷浓度与磷素积累量是烤烟磷营养吸收利用的直观表现［25］。本研究中，随着施磷水平的提高，烤烟地上部与根系磷素积累量和磷浓度均增加，且根系增幅大于地上部，说明提高施磷水平能提高烤烟磷素的吸收能力，磷素亏缺对烤烟根系影响大于地上部。不施磷肥烤烟能维持生长，说明烤烟可通过自我调节适应低磷胁迫，但烤烟生长发育缓慢，株高较矮，有效叶片数少，叶面积也较小。施磷处理农艺形状显著优于不施磷肥处理，但P2与P3处理差异不显著，其原因可能是适量供磷使烤烟形成良好的根系构型，有利于根对养分的吸收，改善根冠结构，提高净光合速率，促进叶肉细胞分裂和栅栏组织伸长，增加叶片厚度，促进叶片扩展，提高单叶重和产量［26］，磷素供应过量，烤烟根系指标与叶片生理指标均有所下降，干物质积累性减少［4］。

4 结论

本研究结果表明，低磷胁迫能诱导烤烟根系分泌大量的有机酸（尤其是苹果酸、乙酸）与酸性磷酸酶，在根际环境中有利于难溶性有机磷的活化与有机磷的水解，从而促进对土壤中磷素的吸收利用，以适应低磷胁迫。但不施磷肥对烤烟磷素的吸收与生长发育仍有明显抑制作用，与正常施磷相比，磷素积累量与磷浓度下降明显，成熟期各项农艺性状表现均不如施磷处理，施用P2O54 g/株与P2O58 g/株烤烟农艺性状差异不显著，生产上为了降低成本与减少水体环境富营养化，可以适当降低施磷量。