三种常用消毒剂对大肠杆菌的杀菌效果试验

揭仕春 三明市将乐县黄潭镇乡村振兴综合服务中心 福建将乐 353300

实验按照国家兽用消毒剂鉴定技术规范（试行）和消毒和灭菌相关标准进行研究，以大肠杆菌作为杀菌对象，进行定量杀菌试验、定性杀菌试验，观察三种消毒剂的杀菌效果，为实际消毒中提供参考。

1 材 料

1.1 试验菌株 大肠杆菌（CMCC44103），购于上海北诺生物科技有限公司。

1.2 药品 戊二醛癸甲溴铵溶液，含戊二醛5%、癸甲溴铵5%，四川永诺生物科技有限公司研制，批准文号：兽药字221306245。聚维酮碘溶液，含碘10%，广州中冠药业有限公司产品，批准文号：兽药字191071577。月苄三甲氯铵，含烃铵盐以C22H40CIN计为9.30%~10.70%，成都民生消毒剂有限公司产品，批准文号：兽药字（2015）220432015。

1.3 试剂 吐温-80、甘氨酸、硫代硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氧化钠均为分析纯，试验用水为纯化水，培养基为营养琼脂培养基、LB液体培养基、肉汤培养基。

1.4 仪器 超净工作台（SW-CF-IF）、普通生化培养箱（LRH-250型）、高压灭菌器（DSX-280-B型）、电热鼓风干燥箱（DHG-9023A型）、电子天平（BS2140型）、数显恒温水浴锅（HH-2型）。

2 方 法

2.1 试验依据 参考兽用消毒剂鉴定技术规范（1992年试行）[1]、GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准[2]。

2.2 试验菌种的制备及活菌计数

2.2.1 菌种复苏 取第三代大肠杆菌复苏，培养于固体培养基平皿上，37℃培养至细菌达到生长平衡期时选择单菌落在固体培养基斜面上传代，作为消毒剂鉴定试验菌种。

2.2.2 配制菌悬液 将固体斜面上的菌种接种到液体培养基中，经37℃培养24 h。

2.2.3 活菌计数 用10倍稀释和平板计数法计数，试验2次。吸取0.1 mL菌液，用倒板和涂布作平行，接种5个梯度（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），将菌液摇匀或涂布均匀后，置37℃培养24 h，选取平均菌数30~300个的平板计数。大肠杆菌10-6稀释梯度的平板符合计数规则，菌落平均数为281个，最终结果为2.8×108CFU/mL。

2.2.4 试验菌液 用0.03 mol/L的PBS将菌悬液稀释成含菌107CFU/mL的试验菌液。

2.3 中和剂选择 根据《兽用消毒剂鉴定技术规范》（1992）和参考文献[3]进行消毒剂中和剂配制，戊二醛癸甲溴铵溶液（戊二醛+癸甲溴铵）配制3%吐温-80+1%甘氨酸；聚维酮碘及月苄三甲氯铵溶液配制0.5%硫代硫酸钠溶液。分六组进行中和剂性能鉴别，一组：消毒剂+菌悬液；二组：（消毒剂+菌悬液）+中和剂；三组：中和剂+菌悬液；四组：（消毒剂+中和剂）+菌悬液；五组：PBS+菌悬液；六组：PBS+中和剂。

2.4 定量杀菌试验 采用参考文献[4]定量杀菌试验，比较三种消毒剂在不同稀释比及作用不同时间对大肠杆菌的杀灭效果。具体操作步骤：按要求配制消毒液；配制菌悬液，浓度为1×107～5×107CFU/mL；取无菌试管，加入0.5 mL菌悬液；取消毒液4 mL注入其中，混匀并记时；待两者相互作用至各预定时间，分别取0.5 mL试验菌与消毒剂混合液加于4.5 mL经灭菌的中和剂中，混匀；各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10 min后，分别取1 mL样液，按活菌计数法计算活菌数，每管样液接种2个平皿；用稀释液代替消毒液进行平行试验，作阳性对照。试验样本均置37℃、48 h后观察结果，试验重复3次。消毒剂杀菌率计算方法：杀菌率=(初始活菌数-平板计数×相应的稀释倍数)/初始活菌数×100%。

2.5 定性法

2.5.1 消毒剂浓度选择 将试管排列于试管架上，标记管号，每个试管加灭菌蒸馏水2.5 mL，置于20±2℃水浴中。于第1管内加消毒液2.5 mL，混匀；取2.5 mL移入第2管，混匀；从第2管中取2.5 mL移入第3管，以此类推直至第9管，混匀后弃去2.5 mL；第10管中不加消毒液，作为对照。用此方法对三种消毒剂分别进行试验。

2.5.2 消毒剂与细菌作用 将菌液进行活菌计数，用稀释液配制成含菌量为5×105～5×106CFU/mL的菌液。加菌悬液2.5 mL于各管中，混匀并记录各管加菌时间，使菌药混合液中含菌量均为105～106CFU/mL。各管分别于加菌2、5、10、30 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL中和剂内中和10 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL营养肉汤管内，置37℃、48 h，观察结果，无菌生长管继续培养至第7 d。

3 结 果

3.1 中和剂试验结果 根据《兽用消毒剂鉴定技术规范》（1992）消毒剂中和剂判定标准即评价规定，试验结果符合以下条件，所测中和剂判为合格：一组不长菌，二组长菌数超过100CFU/mL，三、四、五组间菌数相差不超过10%，六组不长菌。根据中和剂鉴定试验标准，判断所选中和剂及浓度适宜，连续3次试验结果合格。

表1 中和剂试验结果

3.2 定量杀菌试验结果

3.2.1 消毒剂在不同浓度、不同作用时间下的杀菌效果 三种消毒剂在不同条件下的杀灭率结果见表2，由表可知，聚维酮碘、月苄三甲氯铵、戊二醛癸甲溴铵在MBC下作用3 min对大肠杆菌的杀灭率均达到100%。

表2 三种消毒剂不同条件下对大肠杆菌的杀灭率

3.3 定性杀菌试验结果 三种消毒剂分别按1:128、1:64倍稀释，与大肠杆菌作用2 min，戊二醛癸甲溴铵溶液、月苄三甲氯铵溶液杀菌率均达到100%，而聚维酮碘溶液有菌生长；三种消毒剂分别按1:256、1:512倍稀释，与大肠杆菌作用5 min，戊二醛癸甲溴铵溶液杀菌率达到100%（见表3）。

表3 消毒剂对大肠杆菌的定性杀菌作用

4 讨 论

1）通过试验可知，戊二醛癸甲溴铵对大肠杆菌的杀菌作用好于聚维酮碘、月苄三甲氯铵，但是在实际运用中长时间用一种消毒药容易产生耐药性，要每隔一段时间跟换消毒药。而消毒药更换后，根据本试验结果配制溶液的浓度和作用时间就会不同，养殖场在执行消毒措施时，应注意结合消毒剂对病原菌的杀灭效果来配制一定浓度的消毒剂，以确保消毒剂产生有效的消毒效果。虽然试验结果显示戊二醛癸甲溴铵溶液消毒效果最佳，但由于其刺激性大、对人体有害等原因，应用在人员消毒通道时推荐选择对体表和黏膜消毒效果更佳的聚维酮碘。而在场外、道路、环境和场内消毒上，出于价格等因素考虑则可以选择戊二醛癸甲溴铵溶液及月苄三甲氯铵等进行定期轮换使用。

2）规模养殖场在实际消毒过程中，要综合考虑消毒场所的大小及地理位置、消毒对象周围的环境、被消毒物品的性质、天气状况、气温的高低、所处环境病原微生物的种类及多少等因素，决定选择采取消毒的方式方法、消毒药的品种、剂量的大小。总之不管采用什么方式方法消毒，消毒剂品种都要定期更换，进行交叉使用，并制定科学的消毒程序、建立严格的消毒制度，才能确实保证得到良好的消毒效果。

3）养殖场应该采用全进全出的模式，并在每次出栏后按照清理-冲洗-消毒液消毒-熏蒸消毒-火焰消毒的顺序进行一次彻底的消毒，注意冲洗时尽量将污物洗干净，消毒液喷洒时可适当增加消毒药且消毒液要全面湿润环境表面。

4）本试验虽然证实消毒剂戊二醛癸甲溴铵溶液对革兰氏阴性菌大肠杆菌的消毒效果较好，但是该消毒剂对革兰氏阳性菌及其它细菌、芽孢和病毒的消毒试验还需进一步研究，为帮助养殖场消毒用药的选择提供更全面的基础数据。