基于高频相移PQ-Sensor血凝传感仪的研究*

扶 梅，司士辉*，陈金华，冯浪霞，张 润

(1.中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083；2.湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082)

血液循环是人体内部物质运输的主要途径，当其处于高凝状态时，会伴随冠心病、心肌梗塞、血栓栓塞等血液性疾病，直接危害生命健康[1]。血液粘度是反映血液粘滞性的指标之一，体现了血液凝结状态，其与纤维蛋白原的含量有关。因此，纤维蛋白原的测定能为许多疾病的预防、诊断、治疗等提供重要依据[2]。

目前，凝血功能的测定大都以凝固法[3]为主，仪器通过监测凝血因子引起的信号变化来反映血液凝固特性。基于不同响应信号的变化，一些光学、电化学、声学、磁性传感器等已经用于血凝检测过程的研究[4-8]。压电石英传感器[9](Piezoelectric Quartz Sensor，PQ-Sensor)是一种新型、小型化剪切振荡体声波(BAW)声学传感测量仪器，石英晶体在作厚度剪切振动时，谐振参数对液体粘度变化敏感，能够实时监测凝血过程[10-11]。

常规压电石英晶体传感器的频率表征系统由于存在固定时间无法精确监测凝血瞬态过程，多次谐波及泛音频率技术虽然可以提供良好的传感性能，但是也受动态分析的局限性，很难实现连续测量。而压电石英晶体传感器的固定频率相位信号表征系统[12-14]能够降低数据采集拟合时间，可以连续监测响应信号变化，可用于瞬态过程[15]研究。另外，压电石英晶体的质量灵敏度与其基频有关，提高基频可以显著提高灵敏度。因此，考虑到上述两方面的因素，本文开发了一种基于粘度传感的高频相移PQ-Sensor血凝传感仪，研究了其在纤维蛋白原标准溶液、定值质控血浆、静脉血浆中的凝血响应。将仪器响应信号与纤维蛋白原含量进行关联，验证了其可行性、准确性和实用性，为凝血功能的检测提供了一定的指导意义。

1 PQ-Sensor血凝传感仪的设计思路和实验方案

1.1 PQ-Sensor血凝传感仪的设计思路

PQ-Sensor血凝传感仪由传感器、检测片、控温器等三部分组成，其结构如图1所示。传感器是PQ-Sensor血凝传感仪的核心器件，能够实现自动控制和检测；检测片是执行传感功能的敏感元件；控温器采用PID调节用于凝血过程中温度控制。通过这种模块化结构设计，可集数据采集、显示、储存于一体，仪器小型便携，有利于实现实时在线检测。

图1 PQ-Sensor血凝传感仪的示意图

1.2 PQ-Sensor血凝传感仪的实验方案

纤维蛋白原是一种凝血功能蛋白质，是凝血过程和血栓形成过程中的重要物质，纤维蛋白原的含量测定也是凝血功能监测的指标之一[16]。本文的实验方案如图2，利用PQ-Sensor血凝传感仪分别对纤维蛋白原标准溶液、标准定值血浆、静脉血浆进行了测定，通过标准实验和对比实验的探究，对纤维蛋白原含量进行即时定量检测，最终实现了对凝血功能的监测与评估。

图2 实验流程图

2 PQ-Sensor血凝传感仪的设计

2.1 传感器的设计

图3给出了传感器的实物图，其由Arduino Due微控制器、直接数字频率合成器(DDS)、信号放大模块、相敏检波模块、SD存储卡和LED液晶显示屏等组成，这些功能模块共同构建成PQ-Sensor血凝传感仪的核心器件。其中，直接数字频率合成器(DDS)是最重要的功能模块，其包括相位累加器、相位-幅度变换器、数模转换器、低通滤波器等，可以产生高度稳定的频率、相位和振幅可调的正弦信号，为系统提供高达400 MHz的激励信号。

图3 传感器的实物图

传感器工作流程如图4所示，采用LABVIEW软件编程，在电脑上进行参数设置，通过Arduino Due微控制器输入。Arduino Due微控制器采用被动激励相位测量的信号表征方法，控制DDS在一个固定的振幅和频率点进行扫频激励，产生正弦波信号。信号经过转换、放大、滤波降噪等作用于检测片，受压电石英晶体表面负载影响，声波的传播发生变化。改变的信号经滤波、衰减处理，经相敏检波器采集、鉴相调制，送入Arduino Due微控制器进行数据分析和处理。最终，电阻抗信号经过平滑和峰值计算，由LED液晶显示屏在线记录响应信号与响应时间，由SD存储卡实时记录数据变化，通过获得的响应信号来分析电极表面粘弹性变化。

图4 传感器的流程图

与传感器频率响应不同，该仪器由电阻抗信号拟合获得的是与相位有关的响应信号。与频率响应相比，相位响应不易停振，性能更稳定，且相位测量能够进行瞬态信号的监测，可精确到微秒，因此可以进行凝血过程的监测。

2.2 检测片的设计

检测片是由一次性压电石英晶体制备而成，是PQ-Sensor血凝传感仪的重要传感元件。如图5，其有三层结构，分别为基底层、中间层、顶层，基底层由压电石英晶体和铜片电极组成；中间层主要通过镂空设置形成腔室，包括进样室、反应腔室、透气孔；顶层依次圈出进样口、固定试剂区、透气孔。固定试剂区位于压电石英晶体正上方，在其上粘附固定材料，经涂布、晾干、沉积一定量标准浓度的固定试剂。样品通过镂空进样口加入到检测片中，基于毛细张力渗透到压电石英晶体表面，与固定试剂充分接触。

图5 检测片示意图

本文使用未修饰的高频(基本谐振频率100 MHz)镀铝压电石英晶体，在保证仪器性能的前提下减少了成本，降低了技术难度，提高了响应灵敏度。采用无污染、导电性能好、材料附着力高的铝箔片作为固定材料，使用凝血酶时间测定试剂盒中的标准试剂(凝血酶溶液)作为固定试剂。制备过程中，将涂有固定试剂的一面朝下，盖在中间层上，依次组装成血凝检测片。

3 实验分析

实验预处理 将压电石英晶体经乙醇、蒸馏水、磷酸缓冲盐溶液(PBS)反复清洗干净，氮气吹干备用。用0.9%的氯化钠溶液定量稀释纤维蛋白原冻干粉，配制1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的纤维蛋白原标准溶液。选取10组纤维蛋白原含量为0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、4.5 g/L、5.0 g/L的标准定值质控血浆。在医院中收集100份静脉血，取血样0.9 mL，加入0.1 mL 0.109 mol/L枸橼酸钠溶液，3 000 r/min离心10 min，收集上层血浆。将上述溶液分别置于干式恒温仪37℃预热备用。

3.1 标准实验

用移液枪移取10μL不同含量的纤维蛋白原溶液加入到检测片，观察PQ-Sensor血凝传感仪显示屏上的响应信号随响应时间变化。图6为3 g/L纤维蛋白原的测定示意图，图6(a)为响应信号-响应时间动态变化曲线，图6(b)是纤维蛋白原标准溶液与凝血酶标准试剂发生反应后的凝聚态。可以看到，反应过程中响应信号随响应时间呈“阶梯式”下降，减少的信号表明纤维蛋白原与凝血酶之间存在特异性反应，反应后在压电石英晶体表面肉眼可见乳白色凝聚体。

图6 3 g/L纤维蛋白原测定示意图

导出SD存储卡中的数据绘图，获得了图7所示的凝血反应图。图7(a)是3 g/L纤维蛋白原的响应信号-响应时间变化图，开始的一段时间，图像呈一条稳定的直线，对应的响应信号不变，响应信号与激励信号的信号差为0，说明PQ-Sensor血凝传感仪稳定性较好。随着纤维蛋白原与凝血酶的接触，电极表面粘度增大，晶体的响应信号开始下降，这标志着凝血反应的开始，对应时间为t1。反应前期，纤维蛋白原在凝血酶的作用下逐渐转变成纤维蛋白单体，体系的粘度快速增加，晶体的响应信号呈快速的指数下降。反应中期，由于凝血酶溶液的消耗，同时伴随生成的纤维蛋白单体交联形成凝块，体系粘度的增长速度逐渐减缓，晶体的响应信号也开始缓慢下降，tm是最大凝血速度时间点。反应后期，纤维蛋白单体完全交联形成网状结构，体系粘度达到稳定，仪器响应信号不再变化，响应信号差达到稳定，这标志着凝血反应的结束，对应的时间为t2。凝血酶时间(TT)就近似等于t2-t1＝(78-60)s＝18 s。

图7 凝血反应

图7(b)是不同含量纤维蛋白原的响应信号-响应时间变化图，图7(c)是响应信号差和纤维蛋白原含量关系图。图中可观察到，仪器响应信号差和纤维蛋白原的含量成线性相关，表明PQ-Sensor血凝传感仪能够监测纤维蛋白原的含量和凝血酶时间，且实验中可以检测到的纤维蛋白原的量为10μL，说明仪器检测限低、精度高，可用于“微滴”测量。理论上来说，改变固定试剂的种类，还可监测凝血四项的另外两项:凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。更值得一提的是，通过使用不同类型的检测片，该仪器还可实现其他物质的粘度传感。

3.2 对比实验

为了得到仪器的特征检测曲线，我们采用PQSensor血凝传感仪测定十组不同含量的定值质控血浆，通过获得的响应信号与维蛋白原含量作图，得到如图8的标准曲线。根据该标准曲线，对仪器进行标定。

图8 仪器的标定曲线

取10μL血浆分别加入到标定后的PQ-Sensor血凝传感仪和Sysmex凝血分析仪中，分别测定血浆纤维蛋白原(FIB)的含量。将100份血浆样品得到的结果按纤维蛋白原的含量分为三组:低值组、正常组和高值组，分别比较两种仪器的相关性。

如表1，根据统计学规律，三组数据的相关性系数R2>0.954，说明PQ-Sensor血凝传感仪与Sysmex凝血分析仪的检测结果一致性好，同时表明该仪器检测结果可靠，能实际应用于血浆纤维蛋白原的测定。

表1 PQ-Sensor血凝传感仪和Sysmex凝血分析仪的测定结果

4 总结

本文利用固定频率及被动激励相位测量的原理，通过高频设计提高灵敏度，开发了一个即时检验(POCT)的PQ-Sensor血凝传感仪。利用该仪器对纤维蛋白原标准溶液、标准定值血浆和静脉血浆纤维蛋白原进行测定，证明了其可行性、准确性和实用性。该仪器具有便携式、低成本、性能稳定、结果可靠等优点，集程序传输、信号采集、数据处理、功能检测于一体，有望实现全血凝血四项的监测，为社区、家庭等应用场景下的实时在线监测和自我健康管理提供了重要的参考，具有广阔的应用前景和推广使用价值。