胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对HT-29细胞凋亡和上皮细胞间质转化的影响

迟鹏 郝庆 姚艳春 孙玉兰 许德颖 王嘉怡

摘要 目的：研究胡黃连苷Ⅱ联合曲美替尼通过miR-4319对结直肠癌细胞HT-29凋亡和上皮细胞间质转化（EMT）的影响。方法：将结直肠癌细胞HT-29分成6组，分别为对照组、曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组、miR-NC抑制组、miR-4319抑制组，n=9。采用CCK-8实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western Blotting法检测Vimentin、E-cadherin、Bax、C-Caspase-3蛋白表达，qRT-PCR检测miR-4319表达。比较6个组的检测结果。结果：与对照组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组的细胞成活率和Vimentin的表达均减少（均P<0.05），而凋亡率和Bax、C-Caspase-3、E-cadherin的表达均增加（均P<0.05）;与miR-NC抑制组比较，miR-4319抑制组的细胞成活率、Vimentin的表达均显著增加（均P<0.05），细胞凋亡率和Bax、C-Caspase-3、E-cadherin蛋白表达却显著减少（均P<0.05）;qRT-PCR结果显示，与对照组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组细胞中miR-4319的表达增多（均P<0.05）。结论：胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼通过上调miR-4319诱导结直肠癌细胞HT-29凋亡，并抑制细胞EMT。

关键词 胡黄连苷Ⅱ;曲美替尼;结直肠癌;miR-4319;增殖;凋亡;上皮间质转化;HT-29细胞

Effects of Coprininoside Ⅱ Combined with Trametinib in HT-29 Cells Apoptosis and EMT

CHI Peng1，HAO Qing2，YAO Yanchun1，SUN Yulan1，XU Deying3，WANG Jiayi4

（1 Department of Gastroenterology，Anshan Central Hospital Liaoning Province，Anshan 114001，China; 2 Department of Digestive Medicine，Shengjing Hospita Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China; 3 Radiotherapy Department of Panjin Central Hospital of Liaoning Province，Panjin 124010，China; 4 Xiangnan University，Chenzhou 423000，China）

Abstract Objective：To study the effects of cucurbitacin Ⅱ combined with trametinib on the colorectal cancer cells HT-29 apoptosis and epithelial-mesenchymal transition（EMT） through miR-4319.Methods：Colorectal cancer cells HT-29 were divided into 6 groups，namely the a control group，a trametinib group，a coprininoside II group，a combination group，an miR-NC inhibition group，and an miR-4319 inhibition group（n=9）.In 6 groups，CCK-8 experiment was used to detect cell proliferation，flow cytometry was used to detect cell apoptosis，Western blot was used to detect the protein expression of Vimentin，E-cadherin，Bax，and C-Caspase-3，and the expression of miR-4319 was detected by qRT-PCR.Compare the experimental results of the 6 groups.Results：Compared with the control group，the cell survival rate，and the expression of Vimentin in the trametinib group，the berberine Ⅱ group and the combination group were reduced（P<0.05），while the apoptosis rate and the expression of Bax，C-Caspase-3，E-cadherin both increased（P<0.05）; compared with the miR-NC inhibition group，the cell survival rate and Vimentin expression in the miR-4319 inhibition group were significantly increased（P<0.05）.However，the apoptosis rate，the expression of Bax，C-Caspase-3 and E-cadherin were significantly reduced（P<0.05）; qRT-PCR results showed that compared with the control group，the expression of miR-4319 in the cells of the trametinib group and berberineⅡgroup increased（P<0.05）.Conclusion：The combination of cucurbitacin Ⅱ and trametinib induces the apoptosis and inhibits cell EMT of colorectal cancer cells HT-29 by up-regulating miR-4319.

Keywords Cuberitin II; Trametinib; Colorectal cancer; miR-4319; Proliferation; Apoptosis; EMT; HT-29 cells

中图分类号：R271.8文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.012

结直肠癌发病率和致死率极高，是世界范围的公共卫生问题[1-2]。曲美替尼是口服MEK1/2抑制剂，具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。曲美替尼可体外诱导结直肠癌细胞凋亡并抑制细胞增殖[3]。胡黄连苷Ⅱ提取自玄参植物胡黄连根茎，具有抗氧化、预防肝损伤、改善脑损伤等功效[4]。有研究发现，胡黄连苷Ⅱ可诱导肾癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞转移，胡黄连苷Ⅱ可能是抗肿瘤药物[5]。目前胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对结直肠癌细胞的作用鲜有研究。miRNA在人体内普遍表达，参与肿瘤等疾病进展[6]。抗肿瘤药物抑制肿瘤恶性生长的机制与miRNA表达改变有关。我们前期的预实验发现，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可提高结直肠癌细胞中miR-4319表达水平，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼作用机制可能与miR-4319有关。既往文献[7]显示，miR-4319在结直肠癌中发挥类似抑癌基因的作用。本研究探讨胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼调控miR-4319对结直肠癌细胞增殖、凋亡和上皮细胞间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的影響，以期为胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼治疗结直肠癌的临床使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人结直肠癌细胞HT-29购自武汉普诺赛生命科技有限公司，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化、传代。

1.1.2 药物 胡黄连苷Ⅱ（纯度>98%，上海博湖生物科技有限公司，CAS No：39012-20-9）;曲美替尼（上海瀚香生物科技有限公司，CAS No：871700-17-3）。

1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（Gibco公司，美国，货号：16140063）;RPMI-1640培养基（Gibco公司，美国，货号：12633012）;0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美国，货号：SH30042.01）;兔抗Bax抗体（BioVision公司，美国，货号：3032-100）;兔抗C-Caspase-3抗体（Abcam公司，美国，货号：ab2302）;兔抗Vimentin抗体（Thermo公司，美国，货号：PA5-116538）;兔抗E-cadherin抗体（Cell Signaling Technology公司，美国，货号：14472）;兔抗磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Abcam公司，美国，货号：ab245355）;miR-4319 inhibitor、inhibitor control，上海吉玛制药技术有限公司构建。CCK-8试剂盒（MedChemExpress公司，美国，货号：HY-K0301）;流式细胞仪（BD公司，美国，LSRFortessa X-20型）;实时荧光定量PCR分析仪（博日科技股份有限公司，中国，LineGene Mini型）;酶标仪（Thermo公司，美国，MK3型）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8实验[8]分析胡黄连苷Ⅱ对结直肠癌细胞增殖的影响

把结直肠癌细胞接种到96孔板中，细胞完全贴壁以后，更换成含有胡黄连苷Ⅱ为0、1、10、100 μg/mL的细胞培养液，每个浓度梯度3个复孔，常规方法培养48 h以后，在每个孔内添加10 μL的CCK-8，继续孵育2 h。用酶标仪测定OD值，计算细胞成活率。细胞成活率=（对照组OD值/观察组OD值）×100%。

1.2.2 分组与干预

将结直肠癌细胞分成对照组、曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组、miR-NC抑制组、miR-4319抑制组6组。曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组细胞分别在实验0 h时给予1 nmol/L的曲美替尼、1 μg/mL的胡黄连苷Ⅱ处理;联合组、miR-NC抑制组、miR-4319抑制组均在实验0 h时，给予1 nmol/L的曲美替尼和1 μg/mL的胡黄连苷Ⅱ联合处理，同时miR-NC抑制组细胞在实验开始前12 h，细胞转染inhibitor control;miR-4319抑制组细胞在实验开始前12 h，细胞转染miR-4319 inhibitor;对照组常规培养，不做处理。细胞转染根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。对照组、曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组、miR-NC抑制组、miR-4319抑制组细胞培养48 h后，CCK-8法检测增殖（步骤同1.2.1），流式细胞术检测凋亡，Western Blotting方法检测蛋白表达，qRT-PCR方法检测miR-4319表达。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术[9]检测细胞凋亡 用PBS溶液悬浮细胞，1 000×g离心10 min。弃掉上清液，继续添加Binding Buffer，吸取Annexin V-FITC和PI添加至细胞内，在室温孵育15 min，立即用流式细胞仪测定。

1.2.4 Western Blotting方法[10]检测蛋白表达 在细胞中加入RIPA，在冰上裂解30 min。11 000×g离心10 min，取上清液，经BCA方法测定蛋白浓度以后，与5×Loading Buffer混合煮沸5 min。分别在SDS-PAGE上样孔内添加30 μg蛋白样品，设置90 V的电压电泳30 min，110 V电压电泳2 h。在冰上，100 V电压条件下转膜2 h。经过5%脱脂奶粉封闭以后，放在一抗、二抗溶液中，室温结合2 h。C-Caspase-3一抗按照1：800稀释，Vimentin、E-cadherin、Bax一抗按照1∶1 000稀释。二抗按照1∶2 000稀释。ECL方法显色，扫描条带灰度值，以GAPDH作为参照，分析目的蛋白表达变化。目的蛋白表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带GAPDH灰度值。

1.2.5 qRT-PCR方法[11]检测miR-4319表达 在细胞中添加Trizol，提取细胞总RNA，经过紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度以后，用cDNA合成试剂盒反转录。以SYBR Green荧光定量PCR试剂盒检测miR-4319表达，内参为U6，根据2-△△Ct法计算miR-4319表达变化。miR-4319上游引物：5′-CACCCAGAGCAAAGCCAC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度胡黄连苷Ⅱ对结直肠癌细胞增殖的影响

1、10、100 μg/mL的胡黄连苷Ⅱ处理后的结直肠癌细胞成活率降低，与0 μg/mL比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响

与对照组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组结直肠癌细胞成活率降低，细胞凋亡率升高，细胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表达增多（均P<0.05）。与联合组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组结直肠癌细胞成活率偏高，细胞凋亡率偏低，细胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表达较少（均P<0.05）。见图1，表2。

2.3 胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对结直肠癌细胞EMT的影响

与对照组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组结直肠癌细胞中Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白表达水平升高（均P<0.05）。与联合组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组结直肠癌细胞中Vimentin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平降低（均P<0.05）。见图2，表3。

2.4 胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对结直肠癌细胞中miR-4319表达的影响

与对照组比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组、联合组结直肠癌细胞中miR-4319表达水平升高（均P<0.05）。与联合組比较，曲美替尼组、胡黄连苷Ⅱ组结直肠癌细胞miR-4319表达水平降低（均P<0.05）。见表4。

2.5 下调miR-4319对胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼作用下结直肠癌细胞凋亡和EMT的影响

与miR-NC抑制组比较，miR-4319抑制组结直肠癌细胞中miR-4319表达水平降低，细胞凋亡率降低，细胞成活率升高，细胞中Bax、C-Caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平降低，Vimentin蛋白表达水平升高（均P<0.05）。见图3，表5。

3 讨论

直肠癌的发病是一个极为复杂的过程，基因、信号通路相互作用，共同影响肿瘤进展[12]。曲美替尼作为MEK1/2的抑制剂，其可降低结直肠癌细胞增殖能力，诱导细胞凋亡[3]。胡黄连是传统中草药，主要用于黄疸、痔疮肿毒、阴虚骨蒸、吐血等的治疗，胡黄连苷Ⅱ是胡黄连的主要活性成分之一，对肾缺血再灌注等有改善功效[13]。胡黄连苷Ⅱ还具有抗肿瘤作用，并且胡黄连苷Ⅱ还可诱导肾癌细胞凋亡[5-6]。本研究发现，胡黄连苷Ⅱ或曲美替尼抑制结直肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡，并且二者联合效果明显优于单纯使用胡黄连苷Ⅱ或曲美替尼，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可能对结直肠癌的治疗提供新的途径。

细胞凋亡与细胞内多种基因的表达有关，这些基因之间相互作用共同影响细胞凋亡过程[14]。Bcl-2是与细胞凋亡有关的蛋白家族，其蛋白成员Bax促进细胞凋亡。C-Caspase-3是Caspase凋亡级联反应中下游执行因子Caspase-3的活化形式，其水平越高，细胞凋亡程度越高[15-16]。本研究发现，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可提高结直肠癌细胞中Bax、C-Caspase-3蛋白表达水平，说明胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可能通过Bax/Caspase-3信号通路诱导结直肠癌细胞的凋亡。EMT是肿瘤细胞迁移和侵袭的早期标志，Vimentin、E-cadherin分别为间质细胞、上皮图3 miR-4319 inhibitor对胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼影响结直肠癌细胞凋亡和细胞中Bax、C-Caspase-3、Vimentin、E-cadherin蛋白表达的作用  注：A.以流式细胞术测定结直肠癌细胞凋亡;B.以Western Blotting方法检测结直肠癌细胞中Bax、C-Caspase-3、Vimentin、E-cadherin蛋白表达细胞标志蛋白，二者表达改变与EMT水平有关[17-18]。本实验发现，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼降低结直肠癌细胞中Vimentin蛋白表达水平，提高E-cadherin蛋白表达水平，说明胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可抑制结直肠癌细胞的EMT过程。

miRNA在人体内的作用广泛，是指长度为20个核苷酸（nt）左右的小分子非编码RNA，其可通过影响下游基因的表达调控细胞增殖、凋亡[19-20]。本实验显示，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼提高了结直肠癌细胞中miR-4319表达量，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼作用机制可能与miR-4319有关。miR-4319在结直肠癌中表达下调，并且miR-4319低表达与肿瘤患者预后不良有关，过表达miR-4319则明显降低肿瘤细胞恶性程度[7]。有实验发现，miR-4319可抑制甲状腺癌EMT，miR-4319促进细胞中E-cadherin表达，miR-4319在体外能诱导非小细胞肺癌细胞凋亡[21-22]。我们以逆转实验进一步验证了下调miR-4319可削弱胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼对结直肠癌细胞增殖、凋亡和EMT的作用，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可能通过调控miR-4319进而影响结直肠癌细胞凋亡和EMT。

总之，胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼可在体外抑制结直肠癌细胞EMT，促进细胞凋亡，机制与上调miR-4319有关。关于胡黄连苷Ⅱ联合曲美替尼通过何种靶向机制影响miR-4319发挥作用还需进一步探讨。本研究為直肠癌的临床治疗和深入的机制研究奠定了基础。

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（2021-07-06收稿 责任编辑：杨觉雄）