利用LC-MS技术解析黑果枸杞、红果枸杞代谢物的差异

彭玉娇， 崔学宇*， 邵元元， 陈众峰， 杜 潇， 曾文萍， 崔婷婷

（1.南宁师范大学 广西地标作物大数据工程技术研究中心/北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室/广西地表过程与智能模拟重点实验室，广西 南宁530001；2.上海欧易生物医学科技有限公司，上海201210）

宁夏是我国重要的枸杞产地，2018年其产量占我国枸杞总产量的40%，种植面积近7万公顷，种植品种以红果枸杞（Lycium barbarumL.）为主[1]，另有部分黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）种植[2]。黑果枸杞和红果枸杞均为茄科枸杞属多年生灌木，具有重要的药用价值。目前，对黑果枸杞和红果枸杞矿物质、氨基酸、总蛋白质等的差异有一定的报道[1，3-4]，但对其代谢物分析未见报道。在代谢物的层面对其进行研究，有助于黑果枸杞和红果枸杞的差异利用。

前人对枸杞的药用价值已有一定的研究，黑果枸杞和红果枸杞均有提高免疫力、抗疲劳等药用功效[5-9]，黑果枸杞和红果枸杞均富含枸杞多糖、黄酮、生物碱等活性成分。此外黑果枸杞果实中有天然的花青素成分[10-11]，对花青素的研究也是黑果枸杞研究的热点问题[12-15]。另一方面，黑果枸杞和红果枸杞均对干旱等逆境有一定的耐受性，具有一定的生态价值[16-17]。黑果枸杞和红果枸杞在中药上已有一定的应用，但是主要代谢物的差异仍然不清晰。

本研究中利用液相色谱质谱联用技术（LCMS）对宁夏黑果枸杞和红果枸杞进行研究，同时测定其总黄酮的含量，以期明确其主要代谢物差异，为黑果枸杞和红果枸杞加工利用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 样本处理

2019年在宁夏中宁县宁安镇采样，同一基地采集黑果枸杞和红果枸杞，选择4个基地作4次重复采样。晒干后用50℃烘箱烘干后备用[1]。

1.2 实验方法

LC-MS非靶向代谢组测试委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。具体操作包括样品预处理、代谢物提取、LC-MS全扫描检测、数据预处理及统计分析。

质控（QC）样本：所有样本各取等量混合作为QC样本。质谱上机过程中，每4个实验样本中插入一个QC样本，QC样本用于评价整个实验过程中系统质谱平台的稳定性。

本次实验的分析仪器为AB ExionLC超高效液相串联AB TripleTOF 6600 plus高分辨质谱仪组成的液质联用系统。

总黄酮测试委托武汉佰莫生物科技有限公司完成，利用体积分数80%乙醇回流提取，芦丁为对照品进行显色测定。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞和红果枸杞中的代谢产物

黑果枸杞和红果枸杞中合计检测到12 754个物质峰，包括负离子5 844个，正离子6 910个；根据数据库可以比对出的代谢物为6 982种，包括负离子2 704个，正离子4 278个。比对出的部分代谢物种类如表1所示，由表可知，黑果枸杞有更多的代谢物以及特有的代谢物。

表1 黑果枸杞和红果枸杞中鉴定到的代谢物质Table 1 A list of metabolites identified in Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.

2.2 黑果枸杞和红果枸杞的主成分分析（PCA）

利用主成分分析法 （Principle component analysis，PCA）对黑果枸杞、红果枸杞和QC样本的代谢物进行主成分分析（见图1），72.6%的变量可以被解释，QC样本紧密聚集，表明本实验有较好的稳定性和重复性；黑果枸杞和红果枸杞同样在组间聚集，证明了代谢物水平黑果枸杞和红果枸杞可以被区分开。

图1 代谢物的PCA图Fig.1 PCA score plot of the metabolites

续表1

2.3 黑果枸杞和红果枸杞的差异代谢物的筛选

利用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）中的变量权重值（Variable important in projection，VIP）挖掘具有生物学意义的差异代谢物（VIP>1）；利用t检验筛选黑果枸杞和红果枸杞组间差异的显著性（P<0.05）。本研究合计获得501种差异代谢物，其中240种代谢物在黑果枸杞中表达上调，261种代谢物表达下调。对差异代谢物的P值、VIP和变异倍数（Fold change，FC）值进行可视化，如图2所示。

图2 差异代谢物的火山图（黑果枸杞、红果枸杞）Fig.2 Volcano plot of the differential metabolites（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

将显著差异代谢物表达量进行层次聚类（Hierarchical clustering），前50差异代谢物表达量可视化分析如图3所示。在super class层级中，差异表达前50的代谢物包括1个生物碱及其衍生物，1个核苷、核苷酸及其类似物，2个有机杂环化合物，1个有机氧化合物，2个苯丙酸类和聚酮类化合物，4个含氧有机物，4个苯环型化合物，5个未确定分类化合物，6个有机酸及其衍生物，24个脂类及类脂分子。在sub class层级对其分析发现，脂类及类脂分子中的黄酮类（Flavonoids）物质有7种物质，这7种物质分别是Isorhamnetin 3-gentiotrioside-7-glucoside、Kaempferide 3-rhamnoside-7-（6″-succinylglucoside）、Diffutin、Ranupenin 3-rutinoside、Quercetin 3-（6‴-p-coumarylglucosyl）（1->2）-rhamnoside-7-glucoside、Kaempferol 3-rhamnosyl-（1->3）（4‴-p-coumarylrhamnosyl）（1->6）-glucoside和Kaempferol 3-[2‴-（E）-ferulylsophoroside]-7-glucoside；有机酸及其衍生物中的氨基酸和多肽类（Amino acids，peptides）有6种物质，这6种物质分别 是N-（1-Deoxy-1-fructosyl）tyrosine、N-（1-Deoxy-1-fructosyl） proline、N-（1-Deoxy-1-fructosyl） valine、 赖 诺 普 利 （Lisinopril）、NMalonyltryptophan和脯氨酸（L-Proline）。在红果枸杞中表达更高的物质有4种，分别是Diffutin、N-（1-Deoxy-1-fructosyl）proline、赖诺普利和脯氨酸。

图3 前50差异代谢物的聚类热图Fig.3 Heatmap of the top 50 significant differential metabolites

2.4 代谢通路富集分析

差异前20的代谢通路如图4所示，其中被极显著富集的代谢通路有6个（红线以上P＜0.01），这6个分别是氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids），ABC transporters， 氨 酰tRNA生 物 合 成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），精氨酸和脯氨酸代谢（Arginine and proline metabolism），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），亚油酸代谢 （Linoleic acid metabolism）；显著富集的代谢通路有5个（蓝线与红线之间P＜0.05），分别包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生 物 合 成 （Phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis），苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis），黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis），半乳糖代谢（Galactose metabolism）和柠檬酸循环（TCA cycle）。对11个显著差异的代谢通路的富集分析如图5所示。富集分析表明，富集的代谢物数量最多的途径是氨基酸生物合成和ABC transporters，富集因子最大的途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及亚油酸代谢。

图4 差异代谢产物涉及的代谢途径Fig.4 Distribution of metabolic pathways involved in the differential metabolites

图5 富集到的代谢通路相关指标（黑果枸杞、红果枸杞）Fig.5 Related indexes of enriched metabolic pathways（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.5 黑果枸杞和红果枸杞氨基酸代谢相关物质的差异

显著差异的11个代谢通路中有4个涉及氨基酸代谢，对其相关物质进行具体分析，其中共有15种差异代谢物参与，结果如表2所示，其中log2（FC）正值的物质在黑果枸杞中上调，负值为下调。

表2 氨基酸代谢相关的差异代谢物（黑果枸杞、红果枸杞）Table 2 A list of diferential metabolites of amino acid metabolism（Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.6 黑果枸杞和红果枸杞氨总黄酮质量分数及黄酮代谢相关物质的差异

由于前50差异代谢物中数目最多的是黄酮类物质，且黄酮生物合成这一代谢通路被显著富集，所以对其总黄酮含量进行测定。本研究中，黑果枸杞的总黄酮质量分数为（24.43±0.18）mg/g，红果枸杞的总黄酮质量分数为（13.13±0.09）mg/g，黑果枸杞和红果枸杞的总黄酮质量分数存在极显著差异（P＜0.01）。对其相关物质进行具体分析，其中共有5种差异代谢物参与黄酮生物合成，结果如表3所示。

表3 黄酮生物合成代谢相关的差异代谢物（黑果枸杞、红果枸杞）Table 3 A list of diferential metabolites of flavonoid biosynthesis （Lycium ruthenicum Murr.and Lycium barbarum L.）

2.7 讨论

针对代谢物中相对分子质量小于1 500的内源性小分子的研究，以及液相色谱质谱联用技术（LCMS）的应用越来越多[18-19]。本研究合计筛选出代谢物6 982种，黑果枸杞特有的物质比红果枸杞更多，有生物学意义的差异代谢物501种，鉴定到的物质数远超传统的提取方法，代谢物的PCA结果证明了黑果枸杞和红果枸杞可以被显著区分开，这一结果对黑果枸杞和红果枸杞的差异利用提供理论支持。

枸杞黄酮是枸杞中重要的药用活性物质，有较强的抗氧化活性[20-22]。本研究中，差异表达前50的代谢物中黄酮类（Flavonoids）物质有7种物质在黑果枸杞和红果枸杞中存在差异，有6种在黑果枸杞中显著上调，黄酮生物合成相关的代谢通路也被显著富集，5种相关物质发生变化。对总黄酮含量测定发现，黑果枸杞有更高的总黄酮含量，黑果枸杞可能有更好的抗氧化的作用。本研究为黑果枸杞、红果枸杞黄酮的利用以及黄酮含量差异产生的原因提供一定参考。

前人对黑果枸杞和红果枸杞的氨基酸含量进行了一定的研究[23-24]，前人的研究证明了黑果枸杞和红果枸杞中不同氨基酸含量存在一定差异[3]。本研究中，差异表达前50的代谢物中氨基酸和多肽类有6种，其中3种在黑果枸杞中表达更高。有研究表明，枸杞蛋白酶解液可以降低高血压大鼠的血压，但并未对其具体活性成分进行研究[25]。赖诺普利是抗高血压的重要药物[26-28]，本研究发现红果枸杞有更高含量的赖诺普利，该成分可能是枸杞蛋白酶解液可以降压的活性成分之一，因此黑果枸杞和红果枸杞在药用选择上应该区别对待。此外，有4个显著差异的代谢通路涉及氨基酸代谢，这一结果为黑果枸杞和红果枸杞氨基酸差异可能的分子机理做出一定的解释。

3 结 语

本研究得到的代谢物为6 982种，其中黑果枸杞特有的代谢物比红果枸杞多。PCA分析发现，黑果枸杞和红果枸杞可以被显著区分开；合计获得501种差异代谢物，240种代谢物在黑果枸杞中表达上调，261种代谢物表达下调，前50差异代谢物中，有7种是黄酮类物质，6种是氨基酸和多肽类物质，其中调节血压成分的赖诺普利在红果枸杞中含量显著比黑果枸杞高；对总黄酮的含量分析发现，黑果枸杞有更高的总黄酮含量，5种差异代谢物参与到黄酮合成的代谢途径中；共有11个代谢通路被显著富集，其中15种差异代谢物参与4个氨基酸代谢相关通路，这些物质的差异表达可能造成黑果枸杞和红果枸杞氨基酸的差异。本研究为深入了解枸杞中的氨基酸代谢、黄酮代谢，以及对黑果枸杞和红果枸杞的差异利用提供一定依据。