基于DNA检测的硅藻量化实验

刘泉，柯技，王树法

（湖北警官学院，湖北 武汉 430034）

0 引言

水中尸体的检验是法医学实践中的重要工作内容，一般是根据水性肺气肿、蕈样泡沫等特征性的溺死尸体现象来诊断溺死。但在实际检案中，水中的尸体被发现时往往已腐败，这些特征性的尸体现象也因腐败而消失，因此，生前溺死与死后抛尸的诊断常被认为是法医学实践中的难点[1]。

硅藻在腐败的尸体中也能长期存在，因此硅藻检验被认为是生前溺死诊断的重要依据。一般同时在肺、肝、肾等器官中发现与现场水样中形态一致的硅藻，即可诊断为溺死。但部分研究显示，有时在非溺死者体内也能检出硅藻，在溺死者体内却检不出硅藻[2-3]。因此，如何正确认识硅藻检验结果，从技术上减少硅藻检验的假阳性和假阴性结果，是目前法医学研究的热点。

有学者发现在硅藻检验中，对肺组织中的硅藻进行计数，能在一定程度上减少假阳性结果对溺死诊断的影响，而且还在死亡地点推断等方面具有良好的应用前景[4-5]。不仅如此，随着分子生物学技术的不断发展，已有不少研究者将DNA检测应用到溺死诊断领域中，如通过检测水中存在的藻类细菌等与溺死相关的浮游微生物的基因来诊断溺死。普遍观点认为DNA检测技术与传统硅藻检验方法相比具有安全性高、主观因素影响小的优点，有很好的应用前景[6-8]。

目前，有关硅藻DNA特异性片段检测的研究仅限于硅藻的定性研究，未见定量研究。本研究目的是拟通过定量检测硅藻的DNA特异性片段，探索将DNA检测技术与硅藻检验量化体系进行结合，为进一步开展溺死诊断的硅藻量化检验提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂、耗材与仪器

蛋白酶K、DTT、Qubit® dsDNA HS Assay Kit DNA定量试剂盒（Thermo fisher Scientific），纯水；剪刀、钳子、EP管、无菌封口袋、记号笔、烧杯、洗瓶、小型解剖台；高速冷冻离心机（Sigma）、Vortex振荡仪、恒温混匀仪（Eppendorf）、纯水系统（Millipore）、高压蒸汽灭菌锅（Hirayama）、实时荧光定量PCR仪（Thermo）。

1.2 样本准备

1.2.1 硅藻源与实验动物

标准浓度的梅尼小环藻（中科院水生生物研究所提供）；34只雄性实验室SD大鼠，体重300～400 g（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）。

1.2.2 实验模型的制备

水样模型的制备：将500 mL标准水样的梅尼小环藻液体倒入7500 mL，配成第一组水样模型；将250 mL标准水样的梅尼小环藻液体倒入7750 mL，配成第二组水样模型；将125 mL标准水样的梅尼小环藻液体倒入7875 mL，配成第三组水样模型；将62.5 mL标准水样的梅尼小环藻液体倒入7937.5 mL，配成第四组水样模型。

动物模型的制备：34只SD大鼠，被随机分成10组：4个生前溺死组、4个死后抛尸组、1个空白生前溺死组、1个空白死后抛尸组。

生前溺死组：将SD大鼠称重记录，然后放入金属捕鼠笼里，静置30 s，然后连同笼子一起，分别浸入前面制备的水样中1 min，然后提出水面，静置30 s后再沉入水面。按此循环至少5次，直致大鼠死亡，死后的大鼠在溺液中浸泡30 min。

死后抛尸组：将SD大鼠断颈处死，称重记录，抛入溺液中浸泡30 min。

空白生前溺死组：将SD大鼠以同生前溺死组的方式，放入不含有硅藻的纯净水中。

1.3 检材的提取

1.3.1 内脏器官的提取

将处死的SD大鼠，用双蒸水反复冲洗体表，然后用干净的剪刀剪开皮肤，更换干净无硅藻污染的工具，切开肌肉和内脏包膜，更换干净无硅藻污染的工具，取出肝脏，放置干净的器皿中，称重并记录。更换干净的工具，采取同样的方法取出肾脏和两边的肺组织，分别称重并记录。

1.3.2 脏器硅藻DNA提取

取适量称重记录后，放入干净无DNA、RNA污染的50 mL离心管中，加蛋白酶消化过夜；离心，将上清转移到另一干净无DNA、RNA污染的50 mL离心管中，将沉淀转移到2 mL离心管中，向50 mL离心管中加入5 mL NaCl，加95%乙醇至20 mL，向2 mL离心管中加入3% CTAB，离心，弃上清。再向50 mL离心管内加入超纯水；将50 mL离心管内沉淀洗脱，将沉淀转移至2 mL的离心管。重复洗脱步骤一次。将两部分沉淀合并，然后50 ℃放置3 h，向2 mL的离心管中按照一定比例加入氯仿和异戊醇。将上清转移到新的离心管，加入异丙醇，混匀，-20 ℃过夜。离心，上清转移到新的离心管，再加入5 mL NaCl、无水乙醇，混匀，离心，弃上清，将沉淀溶于蒸馏水中，用枪头悬浮溶液，再离心，将上清转移到新编号的离心管，-20 ℃保存备用。

1.3.3 硅藻标准样DNA提取

将取自500 mL标准水样中的20份1 mL硅藻液体离心，弃上清，45 ℃真空干燥，然后加入少量石英砂，研磨充分，使用CTAB法提取DNA。

1.4 单拷贝标记开发

通过目前已经测得的硅藻基因组数据通过Ortho Finder 2软件筛选合适的备选目的片段，并利用Sanger测序验证目的片段扩增长度和准确性。

1.5 DNA扩增实验

1.5.1 荧光定量PCR实验

每个样品分别做不稀释、稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍4个浓度梯度，每个梯度含3个重复。期间，进行40个循环的PCR程序操作，最后通过荧光定量中的溶解曲线，同一样品中不同梯度重复间的差异，扩增曲线的变化来判断测试样本的绝对量。

1.5.2 单拷贝常规PCR扩增

利用高通量测序技术，通过对单拷贝片段的扩增，比较测试样本与标准品高通量测序情况来判定每个测试样品的绝对量。设计了标签引物对每个样品进行特异性标记，选择了30个循环和40个循环两个PCR反应程序，获取高通量测序的产物。

每个样品分别做不稀释、稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍、稀释16倍、稀释32倍、稀释64倍、稀释128倍8个浓度梯度，进行常规PCR扩增。

1.5.3 单拷贝两轮PCR扩增

第一轮PCR先将引物和引导序列引入，第二轮PCR利用引导序列与第二轮引物序列的重叠区将一轮PCR产物富集。每个样品分别做不稀释、稀释2倍、稀释4倍3个浓度梯度，然后进行PCR反应。

2 实验结果

2.1 单拷贝基因片段开发结果

利用软件对现有硅藻基因组进行注释，通过筛选，筛选出单拷贝的18个片段作为候选并设计了引物。后续通过测序进行序列验证，结果显示片段OG0011727获得的目的片段条带短，进一步鉴定结果为梅尼小环藻，为其中比较适合硅藻拷贝数定量的片段，见图1。

图1 单拷贝基因片段电泳结果

2.2 小鼠组织硅藻DNA提取情况

通过DNA提取实验，获得了98份含硅藻的小鼠组织DNA的凝胶电泳图。从图2中可以看出，这些DNA的降解较为严重，片段长度较短。其中，大鼠肾脏和心脏组织中获得的DNA较少，其次为肺脏和脾脏，肝脏中获得的DNA最多。

图2 大鼠组织硅藻DNA提取情况（P：脾脏；S：肾；F：肺；X：心；G：肝）

2.3 标准样DNA提取情况

通过对20个标准样进行DNA提取，发现：20份标准样仅一个（B01）未发现明显的主带；两个样品（B12、B16）含主带但DNA浓度低于其他样品；其余样品均主带明显，见图3。

图3 标准样DNA提取情况

2.4 荧光定量PCR结果

对样本进行荧光定量PCR，发现标准品扩增曲线良好，可重复性好，其余样本样品进行45个循环后仍示未达到平台期，见图4、图5。

图4 标准品扩增曲线

图5 脏器样本扩增曲线

2.5 单拷贝常规PCR结果

2.5.1 30个循环的PCR程序结果

所有样品均未见目的片段扩增阳性带，见图6。

图6 30个循环单拷贝常规PCR结果

2.5.2 40个循环的PCR程序结果

仅标准样扩增情况较好，脏器样本仅在P32的1/64梯度成功扩增目的片段。此后我们尝试过向PCR体系中加入各种辅助试剂（BSA、DMSO等），PCR成功率仍未改观，见图7。

图7 40个循环单拷贝常规PCR结果

2.6 单拷贝两轮PCR结果

硅藻单拷贝专一引物两轮PCR扩增结果显示，标准样在内的所有样本均没有相应的扩增产物扩增成功，见图8。

图8 单拷贝两轮PCR结果

3 讨论

在溺水过程中，当溺水介质流入气道时，天然水中的硅藻会渗透到肺泡系统。硅藻随后广泛分布于周围器官[9]。肺、肝和肾中同时检出硅藻，一般可用于诊断溺死。从笔者以往的实验显示[10]，硅藻实验中能被观察的硅藻的数量与取材量有关，即取材量越大，硅藻数量就越多，硅藻的检测效果也就越好，同时硅藻数量与溺液中硅藻的数量有一定的关系。传统光镜下检验硅藻存在检材消耗量大，实验过程安全性不高，实验过程损耗高，污染系数高等问题，常被法医工作者诟病。随着分子生物学的发展，基因检测技术相较于光镜下检验硅藻有取材用量少、一次性检验样本多、易于浮游生物种属分类、实验过程安全等优势，为辅助溺死诊断提供了新的研究方法。本课题尝试使用DNA技术对硅藻进行定量分析，以期探索更多的硅藻定量检验的方式。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，已有不少研究者将DNA检测应用到溺死诊断领域中，但主要集中在核糖体DNA的检测上，如Jian Tie 等[11]对溺死者组织进行PCR后检测，发现蓝藻的16S rDNA片段用于溺死诊断的灵敏度明显优于传统的硅藻检验法，为除硅藻外的其他藻类辅助诊断溺死提供了依据。何方刚等[12-13]研究表明使用PCR技术扩增浮游生物16SrDNA第三、第四可变区可用于溺死的定性诊断，使用PCR-DGGE法扩增检测相应基因片段还可用于溺死地点的推断等。核糖体DNA主要是转录过程中的产生的基因片段，拷贝倍数没有定论，因此不适宜用作硅藻DNA绝对定量分析。本课题组为解决这个问题，尝试开发单拷贝位点，该单拷贝位点必须具备两个条件：一是较为容易扩增且片段较短，这是由于较长的扩增片段会随着荧光定量PCR体系中酶活力的下降增加实验中的变数，导致实验结果出现偏差；二是所用目的片段应为单拷贝或固定拷贝，这是因为固定拷贝的片段才容易通过比对，从而较为精确开展定量计算。满足以上条件后，当片段在硅藻中为固定拷贝时，测试样品通过与标准样进行比较即可得到该测试样本的绝对定量，无需进行其他复杂换算。为完成这项工作，课题组决定从单拷贝的细胞核基因入手，通过筛选目前已经测得的硅藻基因组数据，得到备选目的片段，然后利用Sanger测序验证目的片段扩增长度和准确性。从实验结果来看，本课题开发的梅尼小环藻的单拷贝目的基因满足以上条件。

在PCR实验中，未检测出目的片段的原因首先是样品中的硅藻拷贝数过低，其次是标准样和测试样品扩增的目的片段不一致，再次是操作失误。尽管本实验中梅尼小环藻的单拷贝目的基因开发顺利，但是从后续实验来看，实验动物样本均未检测出目的片段。为了探寻原因，课题组每类实验均重复了至少2次，并且还使用了不同循环次数的PCR，实验结果显示，重复较多的DNA检测结果显示有少量目的片段，因此，基本排除标准样和测试样品扩增的目的片段不一致或操作失误的两种可能。

综合以上因素，本课题组认为，硅藻DNA检测开展定量检测目前条件还不成熟，主要原因推测有两点：一是单拷贝硅藻DNA的含量过低，不如多拷贝的核糖体DNA检测成功率高，不利于DNA 的检出；二是从大鼠组织硅藻DNA提取情况来看，大鼠组织和硅藻混合性DNA尽管降解严重，但总含量还是比较高，说明大鼠DNA在提取出的DNA混合物中占绝对主导，影响了硅藻DNA的检出。尽管本实验未检出单拷贝硅藻基因，但硅藻的定量检测和DNA检测在溺死诊断中有很好的应用前景，课题组认为下一步如能开发出灵敏度高的固定多拷贝基因片段，将有利于将DNA检测技术运用于硅藻的定量检测中，为溺死的诊断、溺死地点的推断等提供更多的信息。