金钗石斛复方对小鼠免疫功能的影响

张焕新 兰海崇 张冰洁

摘要 為了研究金钗石斛复方对小鼠免疫功能的影响，将实验小鼠随机分为对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组;采用Con A诱导小鼠淋巴细胞转化试验及迟发性变态反应试验测试试验组小鼠的细胞免疫功能;采用抗体生成细胞检测及溶血试验测试其体液免疫功能;采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验测试其特异性免疫功能。结果表明，与对照组比较，金钗石斛复方能够明显提高脾淋巴细胞增殖能力、溶血空斑数、小鼠抗体积数、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;金钗石斛复方对提高小鼠NK细胞活性能力无显著影响。金钗石斛复方对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞功能均有明显的增强作用。

关键词 金钗石斛;复方;免疫功能;小鼠;影响

中图分类号 R 285.5  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）18-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Dendrobium nobile Lindl. Complex Prescription on Immune Function of Mice

ZHANG Huan-xin1， LAN Hai-chong2， ZHANG Bing-jie1

（1.College of Food Science and Technology，Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou，Jiangsu 225300;2.Zunyi Lusheng Kangyuan Technology Development Co.， Ltd.， Zunyi， Guizhou 564100）

Abstract In order to study the effect of Dendrobium nobile compound prescription on immune function of mice， the mice were randomly divided into control group， high dose group， middle dose group and low dose group. The tardive allergy test was used to test the cellular immune function of mice in different experimental groups. The humoral immune function of mice in different experimental groups was tested by antibody-producing cell detection and hemolysis test. The peritoneal macrophage phagocytosis chicken red blood cell test was used to test specific immunity function. The results showed that compared with the control group， the Dendrobium nobile compound prescription could significantly increase the proliferation ability of spleen lymphocytes， the number of hemolytic plaques， the antibody of mice， and the ability of macrophages to phagocytose chicken red blood cells.The Dendrobium nobile compound prescription had no significant effect on the ability to improve the activity of NK cells in mice. Dendrobium nobile complex prescription had obvious enhancement effects on cellular immunity， humoral immunity and macrophage function in normal mice.

Key words Dendrobium nobile Lindl.;Complex prescription;Immunity function;Mice;Effect

作者简介 张焕新（1972—），男，河南叶县人，教授，博士，从事食品加工技术研究。*通信作者，工程师，硕士，从事天然植物成分研究。

收稿日期 2020-09-25;修回日期 2021-04-25

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）为多年生草本，形如古代头上的发钗而得名，大部分分布于西南、华南、台湾等地。金钗石斛是我国传统的名贵中药，在《神农本草经》中列为上品。现代医学研究表明，金钗石斛的主要化学成分是多糖、苷类、生物碱、菲类、酚类等[1]。现代医学和中医药理研究表明，石斛在提高人体免疫能力、抗衰老、抑制肿瘤、补五脏虚劳、降血脂、降血压等方面有明显的效果[2-4]。民间有“救命仙草”之称，俗称药黄金。茶叶味苦、甘、性凉，归心、肺、胃、肾经。茶叶中含有大量茶多酚及儿茶素等类黄酮化合物，还含有大量茶多糖;大量体外及动物试验研究表明茶叶具有显著的免疫增强作用[5-7]。

上述天然原料均为食药两用资源或可用于保健食品的资源，无毒无害。石斛多糖、茶多酚、茶籽油等功能性成分具有增强免疫的功效，配合使用会大大增强其预防或治疗效果。该研究探讨了金钗石斛复方对小鼠免疫功能的影响。

当今社会，随着生活节奏的加快和社会竞争加剧，种种行为都会威胁到人体的免疫力，而免疫力低下人群逐渐增多。由于缺乏针对性的免疫低下治疗措施，加之相关治疗药物对人体有毒副作用，服用保健食品进行干预成为一种理想选择。因此，研究一种具有免疫调节功效的复方具有较高的现实意义和推广价值[8]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI1640培养液，HyClone;小牛血清，Gibco;刀豆蛋白（ConA），aladdin。绵羊红细胞（SRBC），南京茂捷微生物科技有限公司;琼脂糖，GENE COMPANY LTD。2%绵羊红细胞（SRBC），平睿生物科技（北京）有限公司。

1.2 主要仪器

LD5-2A离心机，北京医用离心机厂;XDS-1B显微镜，重庆光电仪器有限公司;UV1750分光光度计，日本岛津;HERA cell 150i CO 2培养箱，美国Thermo Electron公司; NU-430-400E超净工作台，美国NUAIRE。

1.3 实验动物

BALB/c小鼠，SPF级，初始体重18～20 g，雌性，均由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1.4 动物分组与给药方法

40只小鼠随机分为4组，即阴性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只[9]。在前期研究基础上，确定了金钗石斛复方为金钗石斛提取物∶速溶茶粉∶茶籽油=6∶2∶11。其中金钗石斛提取物的多糖含量≥10%，速溶茶粉购于贵州陆圣康源公司，茶多酚含量≥20%。参考成人每日推荐摄入量确定小鼠给药剂量：石斛复方高剂量组（1.2 g/kg）、中剂量组（0.4 g/kg）、低剂量组（0.2 g/kg），给药体积均为0.01 mL/g，给予等体积的蒸馏水作为阴性对照组，灌胃给药，每组10只。各组给相应的药物，每天1次，连续30 d。

1.5 试验方法

1.5.1 脏器/体重比值。

各组灌胃给予受试物，每天1次。连续灌胃30 d后，颈脱臼法处死动物，取其胸腺及脾脏，称重，计算胸腺/体重和脾脏/体重比值[10]。

1.5.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验——MTT法。

根据中国卫生部《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》（下简称《规范》）中脾细胞悬液项目和淋巴细胞增殖反应项目方法进行试验，最后使用紫外分光光度计570 nm测定光密度值（OD）。

1.5.3 抗体生成细胞检测试验——Jerne改良玻片法。

根据《规范》，在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖，干后可长期保存备用。制备脾细胞悬浊液后，计数溶血空斑数[11]。

1.5.4 血清溶血素的测定试验——血凝法。

根据《规范》，两步操作分别是血清分离与凝集反应。每只小鼠腹腔注射0.2 mL 的2%（V/V）压积SRBC的细胞悬液进行免疫。4 d后，摘除眼球取血于离心管内[12]，使血清充分析出，并收集血清，观察不同稀释度的血清血球凝集程度。

1.5.5 小鼠碳廓清试验。

根据《规范》，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨水（0.01 mL/g），待墨汁注入，立即计时。注入墨水后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，并立即将其加到2 mL 0.1% Na 2CO 3溶液中。用紫外分光光度计在600 nm波长处测OD值，以Na 2CO 3溶液作对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，分别去污称重[13]。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算：

K=lgOD 1-lgOD 2t 2-t 1（1）

吞噬指數=体重肝重+脾重×3K（2）

式中，t 1、t 2分别为第1次、第2次采血时间;OD 1、OD 2分别为t 1、t 2对应的吸光度。

1.5.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验——滴片法。

根据《规范》，试验前4 d给每只小鼠腹腔注射2%压积绵羊血红细胞0.2 mL。准备洁净的载玻片，分别标号，一系列操作后，于40×显微镜下计数吞噬率和吞噬指数。每张片计数100个巨噬细胞，吞噬率的意义是每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率;吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数[14]。计算公式如下：

吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数×100%（3）

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数（4）

1.5.7 NK细胞活性测定试验。

根据《规范》，试验前24 h将靶细胞进行传代培养。最后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min;每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL;37 ℃反应3 min，每孔加入1 mol/L HCl 30 μL，在酶标仪490 nm处测定OD值。NK细胞活性计算公式如下：

NK细胞活性=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100%（5）

1.6 数据统计

采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）和回归方程分析[15]，结果以平均值±标准偏差表示，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 金钗石斛复方对小鼠胸腺、脾脏器官的影响

金钗石斛复方高、中、低剂量组对小鼠脏器/体重比值的影响结果见表1。经对高、中、低剂量组及对照组的资料进行单因素方差分析，整体比较均为不显著（P>0.05）。几个组相互比较并结合数据来看，给药组小鼠胸腺系数、脾脏系数较对照组没有明显升高，与对照组比较没有显著差异（P>0.05）。

2.2 金钗石斛复方对小鼠ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

从金钗石斛复方对小鼠ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响结果（表2）可以看出，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高剂量组可以明显提高脾淋巴细胞增殖能力（P<0.01），结果可以判定为阳性。

2.3 金钗石斛复方对小鼠抗体生成细胞的影响

溶血空斑是在补体参与下溶解周围SRBC形成的透明溶血区域，是反映机体体液免疫功能的经典试验之一。金钗石斛复方溶血空斑试验结果见表3，分析表明，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高、中剂量组均能够明显提高小鼠的溶血空斑数（P<0.01），可判定阳性。

2.4 金钗石斛复方对小鼠血清溶血素的影响

从金钗石斛复方小鼠血清溶血素试验结果（表4）可以看出，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高、中、低剂量组均可以提高抗体积数（P<0.01）。由于抗体积数越大说明血清抗体越高，当受试样品组的抗体水平显著高于对照组的抗体水平，则可判定结果阳性。

2.5 金钗石斛复方对小鼠碳廓清的影响

小鼠碳廓清反映的是巨噬细胞吞噬功能试验，结果见表5。数据分析表明，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高、中、低剂量组均无明显提高小鼠的吞噬指数，结果没有统计学意义（P>0.05）。

2.6 金钗石斛复方对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响

巨噬细胞活力与功能是免疫功能的重要体现与指标之一，当巨噬细胞与颗粒物质鸡红细胞混合孵育后，鸡红细胞即被吞噬，镜检其结果可以反映免疫功能的强弱。金钗石斛复方小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验结果见表6，经数据分析表明，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高剂量组可以明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力（P<0.01）[16]。

2.7 金钗石斛复方对小鼠NK细胞活性的影响

从表7可以看出，与阴性对照组比较，金钗石斛复方高剂量组、中剂量组、低剂量组均没有明显提高小鼠NK细胞活性能力（P>0.05）。

3 小结

ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验中，金钗石斛复方高剂量组与阴性对照组比较可以明显提高脾淋巴细胞增殖能力（P<0.01），可判定细胞免疫功能测定结果阳性。抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）试验中，金钗石斛复方高、中剂量组与阴性对照组比较均可以明显提高小鼠的溶血空斑数（P<0.01）;金钗石斛复方高、中、低剂量组与阴性对照组比较均可以提高小鼠抗体积数（P<0.01），可判定体液免疫功能测定结果阳性。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬雞红细胞试验中，金钗石斛复方高剂量组与阴性对照组比较可以明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力（P<0.01），可判定单核-巨噬细胞功能测定结果阳性。综上所述，金钗石斛复方能明显增强机体的细胞免疫、体液免疫功能和巨噬细胞功能，具有明显的免疫增强作用。

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