苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性及生防效果

吕亮，陈娇 ，郭志敏，吕为，陶佩文 ， 吕惠红 ，潘哲群，常向前，万鹏，张舒

1.农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/湖北省农业科学院植保土肥研究所，武汉 430064；2.武汉武大绿洲生物技术有限公司，武汉 430072；3.华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070

草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)是2019年首次由缅甸迁入我国的杂食性迁飞害虫，并迅速扩散至我国26个省市区的1 518个县，已严重威胁我国的粮食安全[1]。迄今在草地贪夜蛾的防治策略中，控制草地贪夜蛾的暴发为害仍依靠于化学农药的大量使用。而化学农药的过度施用，极易造成害虫抗药性、再猖獗以及环境残留和污染等一系列严重的问题，严重制约了现代农业的可持续发展。因此，采用生物防治方法或生物农药替代化学农药来控制草地贪夜蛾越来越重要，并日益受到重视[2-3]。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)是从苜蓿银纹夜蛾幼虫中分离出的1株多粒包埋的核型多角体病毒[4]，它能交叉感染甜菜夜蛾、小菜蛾、银纹夜蛾、斜纹夜蛾等30多种鳞翅目害虫[5]，以Bt等多种杀虫剂和非靶标害虫病毒作为增效剂的混配剂型对许多夜蛾科害虫具有明显的增效作用，并进一步拓宽了杀虫谱，提高了杀虫效果[6-7]。苜核·苏云菌悬浮剂是武汉武大绿洲生物技术有限公司研发的昆虫病毒新型生物农药，由苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒加入Bt高效病毒增效剂复配而成，具有良好的杀虫活性，已在蔬菜、果树、水稻等大面积应用[8]。

本研究通过室内活性测定、田间试验等方法检测和评价苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾的杀虫活性和生防效果，以期为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒在玉米草地贪夜蛾的生物防治中得到广泛应用提供数据支撑，最终为苜核·苏云菌悬浮剂在防治草地贪夜蛾上的登记应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试病毒、生物药剂

供试病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。2019年5月20日于湖北省仙桃市玉米田采集草地贪夜蛾，在武汉武大绿洲生物技术有限公司于室内进行病毒感染筛选试验(其中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫具有较高的感染活性)，并用饲养的草地贪夜蛾幼虫进行增殖扩繁。将感染病毒的幼虫尸体加水研磨，经3层纱布过滤，滤液经600 r/min和3 000 r/min差速离心，显微计数为每mL含有1.8×1010个病毒多角体 (polyhedral inclusion body,PIB)，即得较纯的多角体病毒母液(记浓度为1.8×1010PIB/mL)，于低温保存备用。

供试生物药剂为苜核·苏云菌悬浮剂(1.0×107PIB/mL)。由武汉武大绿洲生物技术有限公司研制，并由其子公司武汉楚强生物科技有限公司生产。

1.2 供试昆虫

供试昆虫为草地贪夜蛾，在湖北省通山县大畈镇板桥村夏季玉米地，于2019年7月20日采获草地贪夜蛾高龄幼虫，带回湖北省农业科学院植保土肥研究所实验室，采用新鲜嫩玉米叶于一次性塑料培养皿(直径8 cm，高3 cm)中单头饲养。草地贪夜蛾的室内饲养条件为：(25±1) ℃，相对湿度60%～70%，光周期为16L∶8D。繁殖多代后留取新鲜并经消毒处理的卵块备用。

1.3 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫的室内活性测定

本试验设计了1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104等6个浓度梯度。即先将配制的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒母液倍数稀释成 1.0×109PIB/mL，然后经多次10倍稀释得到其他不同浓度的稀释液。试验设空白对照处理，共计7个处理，每处理重复3次。

试验方法采用叶段喂毒法，即事先用病毒悬浮液喷雾处理新鲜玉米嫩叶段(长2 cm ×宽2 cm)，接入幼虫进行饲喂，并用培养皿进行单头饲养，饲养条件为：温度(25±1) ℃，相对湿度60%～70%，光周期为16L∶8D。待含毒玉米叶段被取食完后，立即补充新鲜无毒玉米叶段。每重复处理48头草地贪夜蛾2龄幼虫。参考文献[9-11]，综合考虑该病毒在夜蛾科昆虫细胞与寄主上增殖的变化，确定于接虫后7、10 d调查因病毒死亡虫数和总死亡虫数，统计死亡率并计算LC50等数据。

1.4 1千万苜核·苏云菌悬浮剂对草地贪夜蛾幼虫的田间防效试验

田间药效试验在湖北省通山县闯王镇小源村夏季玉米地进行。该试验地块总共1 500 m2，土质类型为石灰性泥土，pH值为6.8，有机质含量13.9%，肥力中等偏上。常年种植玉米，种植玉米品种为西玉三号，2020年7月13日施45%复合肥750 kg/hm2做底肥并播种。该田块自2019年以来，草地贪夜蛾发生为害严重。

试验共设计1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm2)、常用杀虫剂15%甲维·茚虫威悬浮剂(300 mL/hm2)以及空白对照 3个处理。每处理重复4次，共计12个试验小区，每小区面积为100 m2。

于2020年8月26日(草地贪夜蛾低龄幼虫多发期)近傍晚时一次喷雾施药。使用乐帮手牌3WBJ-16DZ多功能背负式电动喷雾器，工作压力0.40～0.60 MPa，喷孔口径1 mm，流量60～85 L/h。施药当日为晴天，气温23～32 ℃。于施药后第1、3、5、7、10、15天调查。调查时，每小区取10个随机样点，每点连续调查10株，共计100株，记录每株玉米上活虫数、死亡数、中毒情况及天敌数量。相关计算公式如下：

防治效果=

1.5 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的分子鉴定

1) 供试病毒样本。事先选取室内活性测定时的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒母液(记样品1)、生物制剂1千万苜核·苏云菌悬浮剂(记样品2)、 田间药效试验后病毒感染虫尸(记样品3)、样品3中采集的虫尸感染的草地贪夜蛾第2代幼虫虫尸(记样品4)作为供试病毒样本，以验证1千万苜核·苏云菌悬浮剂中AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫是否具有杀灭活性。

2)DNA提取。取AcMNPV试样1.0 mL，加入99.0 mL蒸馏水，充分振荡1 min；取振荡后的混悬液300 μL，加入100 μL 碱裂解液，于 37 ℃水浴30 min；再加入200 μL Tris·HCl缓冲液， 10 000 r/min离心8 min，取上清液于离心管中；加入5 μL蛋白酶K和60 μL SDS， 于65 ℃水浴2 h，取出冷却至室温；再加入650 μL Tris饱和苯酚混匀， 10 000 r/min离心5 min，取上清液于新离心管中；于转入上清液的离心管中加入650 μL苯酚∶氯仿(体积比1∶1)混合液，10 000 r/min离心5 min，再取上清液于新离心管中；于上清液中加入650 μL氯仿∶异戊醇混合液(体积比24∶1)，10 000 r/min离心5 min，最后取上清液保存于新离心管中，并用分光光度计测定DNA浓度。

3)PCR扩增。采用T3 super mix标准体系：试样DNA 2 μL，前后引物各0.5 μL，T3 super mix 18 μL和ddH2O 7 μL。PCR扩增条件为95 ℃，3 min预变性后，进行以下循环：98 ℃ 15 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，最后再72 ℃延伸5 min;循环42次。

4)DNA琼脂糖凝胶电泳。取PCR扩增产物2 μL及5 kb DNA Marker点样于琼脂糖凝胶中，180 V电压下电泳20 min。电泳结束后在凝胶成像系统中观察PCR产物。

凝胶成像系统中观察到分子质量大小正确的PCR产物，用polh、lef-8、lef-9基因PCR扩增引物对PCR产物进行DNA测序。各基因引物如下：

polh上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGGGCTGAGGATCCTTT

polh下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACTGGTGCAAACTCCTT

lef-8上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGCACGGCGAAATGAC

lef-8下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACATGTACGGATCTTCGGC

lef-9上游引物：AGGGTTTTCCCAGTCACGAAAAACGGGTACGCGG

lef-9下游引物：GAGCGGATAACAATTTCACACTTGTCACCGTCGCAGTC

最后应用DNAMAN 6.0软件对所测到的polh、lef-8、lef-9序列进行比对。

1.6 数据分析与处理

试验数据应用IBM SPSS 22.0数据统计分析软件进行处理。

病毒杀虫活性测定试验中统计各浓度处理死活虫数，计算死亡率、校正死亡率并转换成概率值，各处理浓度转换成lg值，通过工作概率值及权重等计算得毒力回归方程(slope ± SE)，求出LC50值及其95%的置信限，最后进行卡方(χ2)检验；田间防效试验中，统计各处理活虫数，计算虫口减退率，用Microsoft Excel编辑公式求出防治效果，并采用Duncan’s法进行分析，用单因素方差分析比较处理间差异显著性。

文中图表均采用Microsoft Excel软件进行制作。

2 结果与分析

2.1 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性

室内活性测定的结果(表1)显示，处理7 d后，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC50为4.1×107PIB/mL，LC90为1.05×108PIB/mL；而处理10 d后，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对2龄幼虫的LC50为2.9×107PIB/mL，LC90为7.8×107PIB/mL。可见苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒处理草地贪夜蛾2龄幼虫7 d后的LC50、LC90均高于10 d后的LC50和LC90，即7 d时苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫表现出较好的杀虫活性。

表1 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾2龄幼虫的生物测定 Table 1 Bio-activity of AcMNPV acts on the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda (Means ± SE)

2.2 苜核·苏云菌对草地贪夜蛾幼虫的田间防治效果

田间药效试验结果显示，1千万苜核·苏云菌SC(1 500 mL/hm2)对草地贪夜蛾幼虫起作用效果比较慢。在喷施用药后第1、3、5天的平均防效分别为11.57%、16.23%、15.56%，用药后第7天的平均防效也只有21.88%，但用药后第10天的虫口防效突然上升到68.99%，且用药后第15 天的平均防效亦有66.87%。而对照化学药剂15%甲维·茚虫威SC(300 mL/hm2)对草地贪夜蛾幼虫有很好的杀灭效果，能迅速降低虫口数量，用药后第1、3、5、7 天的平均防效分别为91.39%、92.66%、90.71%和87.19%，但其药后第10 天的平均防效开始下降，仅为67.63%，且药后第15天的平均防效已下降至51.60%。详见表2。

同时我们也发现，空白对照区的虫口减退率在处理后第1、3、5 天均为负数，即说明虫口数量在增长，而在处理后第7 天开始变为正数(虫口开始下降)，其第10 天和第15天 的平均虫口减退率分别达到38.25%、47.00%，极有可能与第10～15 天后草地贪夜蛾的幼虫有部分开始入土化蛹以及世代重叠等原因有关。

综上可见，供试药剂1千万苜核·苏云菌SC(1 500 mL/hm2)对草地贪夜蛾是有一定的防治效果的，但起作用较慢，发挥药效约在第10～15 天。

表2 1千万苜核·苏云菌悬浮剂对草地贪夜蛾幼虫的田间试验结果 Table 2 Control effect of the compounds of 107 PIB/mL AcMNPV + Bt suspension against the larvae of Spodoptera frugiperda %

2.3 苜核·苏云菌对天敌的影响

田间试验时，同时调查了1千万苜核·苏云菌悬浮剂对玉米上害虫天敌(蜘蛛、瓢虫、隐翅虫等)的影响，结果显示，1千万苜核·苏云菌悬浮剂对蜘蛛、瓢虫和隐翅虫等天敌未见有明显的伤害作用，平均百株有各类天敌13.4头，而对照化学农药15%甲维·茚虫威悬浮剂药后对蜘蛛、瓢虫和隐翅虫等天敌则有明显的毒杀作用，其药后第1天调查时，平均百株玉米上仅为3.1头，药后第3 天调查每百株玉米上亦只有各类天敌5.2头(图1)。可见1千万苜核·苏云菌悬浮剂对害虫天敌有较好的保护作用，而15%甲维·茚虫威悬浮剂对天敌的伤害相对较大。

图1 1千万苜核苏云菌SC、15%甲维茚虫威SC对天敌的影响Fig.1 The effect of 107 PIB/mL AcMNPV + Bt Suspension and Emamectin Benzoate+Indoxair Conditioningarb 15% Suspension on nature enemies of Spodoptera frugiperda

2.4 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的分子鉴定

不同供试病毒样品的PCR扩增结果显示，样品1、2、3、4的polh、lef-8、lef-9扩增片段大小一致且正确，polh、lef-8、lef-9基因PCR产物的大小分别为0.540、0.716和0.290 kb (图2)，即可证明AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫有杀虫活性。

1:样品1 Sample 1; 2:样品2 Sample 2; 3:样品3 Sample 3; 4:样品4 Sample 4; M:DL 5 000标准 DL 5 000 marker.图2 AcMNPV不同试验样品的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of different AcMNPV test samples

应用DNAMAN 6.0软件对样品1、2、3、4中的polh、lef-8、lef-9扩增片段进行序列比对，结果(图3)表明，样品1、2、3、4的polh、lef-8 、lef-9扩增序列间相似度均为100%，说明样品1、2、3、4均来自于同一种病毒AcMNPV。

3 讨 论

苜核银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是一种昆虫杆状病毒，害虫通过取食感染病毒后，病毒会在昆虫体内增殖扩繁，会陆续感染全身，最终导致死亡。本研究结果表明，苜核银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫有较好的生物活性，其第7 天和第10 天的LC50分别4.1×107、2.9×107PIB/mL，且在田间表现出较好的防治效果，其混配的1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm2)药后第10天、15 天的平均防效较好，分别达到68.99%和66.87%，且对天敌安全。因此应加快研发速度，以便AcMNPV 在草地贪夜蛾的生物防治中发挥更大的作用。武汉楚强生物科技有限公司生产的1千万苜核·苏云菌悬浮剂是由AcMNPV与生物农药苏云金杆菌(Bt )复配而成的，可以显著提高病毒的杀虫活性。因为Bt是一种广谱性杀虫剂，具有较好的微生物杀虫活性，当AcMNPV与Bt复配后，其毒力比单一型制剂应该有明显提高，不仅扩大了Bt的杀虫范围，而且提高了其毒力，达到一种制剂防治多种害虫的目的[12]，这也是1千万苜核·苏云菌悬浮剂在蔬菜、果树和水稻上能够大面积推广的原因所在。因此，1千万苜核·苏云菌悬浮剂应可作为草地贪夜蛾绿色防控的防治药剂在玉米上推广。

图3 应用DNAMAN 6.0软件对polh、lef-8、lef-9基因进行序列比对结果Fig.3 Results of sequence alignment of polh,lef-8 and lef-9 genes were analyzed by DNAMAN 6.0 software

进行田间药效试验时，在空白对照区虫口减退很快的情况下(第15天的虫口减退率达到47.00%)，1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm2)在药后第15 天的平均防效达到 66.87%，呈快速上升态势，而化学农药15%甲维·茚虫威SC(300 mL/hm2) 药后第15 天的平均防效却下降至51.60%。虽然从“一升一降” 中可看出供试药剂1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm2)对草地贪夜蛾在第10～15 天时具有一定的防治效果，但考虑到生物农药起效慢以及草地贪夜蛾幼虫历期短、世代重叠等原因，建议在进行生物农药(特别是病毒制剂)田间药效试验时应酌情增加调查次数，延长调查时间，可能会取得更理想的试验结果。这一点也是本研究的不足之处。总之，化学药剂与生物药剂相比，杀灭害虫效果相对较高，起效快，应当作为害虫暴发时的一种应急防治措施。而对于害虫发生相对较轻时，生物农药可代替化学农药作为绿色防控技术措施之一，从而减轻环境污染，达到保护农业生态的效果。

另外，本研究中使用的polh(polyhedrin)基因是一类多角体蛋白启动子，和p10是杆状病毒表达载体系统(BEVS)中最常用启动子，均在病毒感染晚期大量表达[13]。但p10启动子的活性次于polh启动子，因此，polh启动子常被用于外源蛋白的表达。而基因lef-8能编码病毒自身RNA聚合酶的最大亚基，是一类晚期表达因子[14]。lef-9是在杆状病毒中与lef-4、lef-8和p47一起共同编码蛋白联合体亚基的一类晚期表达因子，研究发现，缺失lef-9基因病毒是不能生成具有感染活性的病毒粒子的，而补回lef-9基因病毒则可恢复病毒的感染活性，因此，lef-9 基因是杆状病毒形成具有感染活性BV(budded virus)的必需基因[15]。可见，lef-8和lef-9基因在不同种类的核型多角体病毒中具有较高的保守性，故而lef-8和lef-9基因可作为鉴定病毒种类的依据。因此，本研究以polh、lef-8和lef-9为检测对象，通过基因序列比对，同源性均达到100%，以分子快速检测方式再次验证了AcMNPV对草地贪夜蛾具有较好的杀虫活性，适合在草地贪夜蛾防控中进一步推广应用。

草地贪夜蛾自2019年入侵我国，已成为玉米重要害虫，并在华南、西南部分地区形成定殖种群，给我国玉米产业造成巨大损失，严重威胁着我国的粮食安全[16]。面对当前草地贪夜蛾国内严峻的防控形势，加快筛选和研发草地贪夜蛾防控的高效药剂是当务之急[17]。虽然病毒杀虫剂由于其作用速度慢、杀虫谱窄等问题影响了其广泛应用，但在日益重视生态、环境保护的背景下，杆状病毒杀虫剂由于其相对传统农药的显著优势，在农业生产上定会得到越来越广泛的应用。而由于昆虫病毒制剂极易受高温、阳光、雨淋、害虫虫龄等外界条件影响[18]，故建议选择在害虫低龄幼虫发生高峰期施药，最好选择在晴天16：00-17:00使用，避开高温和光照等不利环境条件的影响，以使病毒制剂能更好地发挥作用，提高对害虫的防治效果。