生草栽培对纽荷尔脐橙根系生长土壤微生物群落的影响

管冠 郭等等 李倩磊 姚锋先 刘桂东

摘要：赣南地区是我国脐橙主产区，脐橙产业已经成为赣南地区的支柱产业，然而传统清耕果园土壤退化现象日益突出，严重制约了当地脐橙产业的发展。采用生草盆栽试验，以裸露土壤为对照，比较各生草处理的pH值、有机质含量、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量及根系生长状况、土壤微生物数量、土壤微生物多样性。结果表明，相比裸露土壤，无分隔处理SC4和尼龙袋分隔处理SC3显著提高了土壤有机质含量、脐橙根系生长发育、微生物数量、AWCD值和Shanon-Wiener、PD-Whole-tree指数，且尼龙袋分隔处理SC3中独有的OTU数量显著高于其他处理。生草栽培有利于纽荷尔脐橙根系生长、土壤理化性状改善及脐橙产业的可持续发展。

关键词：生草栽培;纽荷尔脐橙;根系;土壤微生物;赣南地区

中图分类号：S666.406   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）17-0220-06

收稿日期：2021-03-12

基金项目：江西省重点研发计划重大项目（编号：20192ACB80009）;江西省教育厅科技项目（编号：GJJ180759）;江西省自然科学基金（编号：20202BABL215029）。

作者简介：管 冠（1985—），男，湖北黄石人，博士，副教授，主要从事土壤生物学研究。E-mail：guanguan_1985@aliyun.com。

赣南地区年产百万吨脐橙，是全国面积最大、产量最高的产区，在世界脐橙产业中也数一数二，被誉为“世界橙乡”[1]。其中，纽荷尔脐橙种植面积最大[2]，赣南脐橙有肉质脆嫩、化渣，风味芳香，口感酸甜适中等特色，果实远销海内外。近年来，其种植规模大大增加，已经成为赣南地区经济发展的支柱產业。赣南地域主要以山地和丘陵为主，土壤有机质含量低、酸度高，赣南地区的果农主要采用传统的清耕栽培技术。由此，土壤肥力下降问题越来越严重，果园的品质和产量也日益下降[3]，这不仅影响果农的经济情况，也严重制约我国脐橙产业的可持续发展。为了解决这一问题，政府引进生草栽培技术，并大力推广。果园生草栽培就是在果园全园或果树行间人工种草或者自然生草的栽培模式。它具有改善土壤结构、提高土壤肥力[4-6]、提高果园的品质和产量的优势[7]。

植物根系直接影响植物地上部碳水化合物的合成和转化。植物根系越发达、根表面积越大，则对土壤养分吸收能力越强。根系的生长发育受土壤理化性质及土壤养分含量的影响，同时，根系的生长状况又会对土壤环境产生影响。土壤理化性质越优越、养分含量越高，越能促进植物根系的生长发育，进而促进植物的营养生长[7]。根际土壤微生物是土壤生态结构中最活跃的组成部分，它在腐殖质的形成、有机质及矿物质的分解、土壤养分的循环和转化过程中发挥着重要作用[8]。根际微生物群落组成不仅反映生物活性水平，其代谢产物和植物根系分泌物还作用于土壤环境，影响土壤养分的吸收利用以及植物根系生态系统[9]的稳定性。因此，研究根际土壤微生物的影响因素，对于改善土壤环境、提高土壤肥力、促进根系生长和土壤的可持续利用具有重要意义[10]。大量研究表明，影响根际土壤微生物的因素主要有土壤环境、土壤微生物自身、植被多样性、动物多样性等[11-12]。而生草栽培模式有助于改善土壤物理性质，增加土壤养分含量与土壤微生物种类数量[13]，促进植物根系和果树的生长。植物土壤-根系-微生物三者相互影响，相互促进。

脐橙果园土壤退化是长期性的持续过程，在笔者前期的田间试验中发现，生草栽培模式能够很好地提高土壤酶活性，有效地控制果园土壤的退化过程，但对于其中的机制研究还不够深入。因此，探讨生草栽培对脐橙根系生长和土壤微生物群落的影响具有重要意义。本研究以赣南脐橙园土壤为研究对象，设计盆栽试验探讨生草栽培对脐橙根系、土壤微生物群落的影响。研究结果有助于明确脐橙根系生长对生草栽培的响应机制，从理论上丰富脐橙根际环境的微生物动态变化过程。

1 材料与方法

1.1 试验材料与盆栽试验设计

选取长势基本均一的枳砧纽荷尔为供试植株，购于赣州江口无病毒苗木繁育基地，设计盆栽试验。试验于2019年12月在赣南师范大学脐橙学院西侧网棚进行，生草栽培草种选用田间常见的百喜草（Paspalum notatum Flugge），播种量为2 g/盆，以裸露土壤的清耕栽培模式为对照。试验共设置5个处理：（1）裸露土壤，无植株种植，无百喜草覆盖（CK）;（2）种植纽荷尔植株，无百喜草覆盖（SC1）;（3）种植纽荷尔植株，覆盖百喜草，塑料盆分隔（SC2）;（4）种植纽荷尔植株，覆盖百喜草，尼龙袋分隔（SC3）;（5）种植纽荷尔植株，覆盖百喜草，无分隔（SC4）。试验采用完全随机区组试验设计，共设置6个小区，每小区包含5个处理，每处理包含3次重复。

塑料盆分隔（完全分隔）：将纽荷尔脐橙苗移栽于直径40 cm、高35 cm的塑料花盆中，然后将其整体栽种在直径50 cm、高45 cm的营养钵内（总装土量为40 kg，下同）。在塑料盆和营养钵之间种植百喜草2 g（下同）。此分隔方式下，脐橙根系和草根完全隔离，草根本体及其根系分泌物均不可对脐橙根系产生影响。

尼龙袋分隔：将纽荷尔脐橙苗移栽于直径 40 cm、高35 cm的300目尼龙袋中，然后将其整体栽种在直径50 cm、高45 cm的营养钵内。在尼龙袋和营养钵之间种植百喜草。此分隔方式下，草根本体对脐橙根系没有影响，但草根根系分泌物可对脐橙根系产生影响，且水、肥也可自由通过。

无分隔种植：将纽荷尔脐橙幼苗移栽于直径 50 cm、高45 cm的营养钵内。在距离树干15 cm外的周围种植百喜草。此栽培情况下，脐橙根系和草根均可自由生长，二者的根系本体及根系分泌物均可互相作用。

1.2 土壤及植物根系样品的采样时间与采样方法

在盆栽试验布置完毕后，6个月后取样1次、12个月后取样1次，试验持续1年。将土样剔除杂物后，装入自封袋内，并放入冰盒。带回实验室后分成2份，一份新鲜土样过筛（2 mm）后4 ℃保存，用于微生物多样性分析;另一份土样经去杂风干过筛后4 ℃保存，用于土壤理化性质的测定。把脐橙根系从盆栽里小心取出，清水冲洗干净，装入牛皮纸信封后带回实验室待测。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤基本理化性状分析 土壤基本理化性质的测定参照文献[14]进行。土壤pH值的测定采用pH计法测定（水土比2 ∶1）;土壤有机质含量的测定采用H2SO4-K2CrO7高温外热-容量法;土壤碱解氮含量的测定采用碱解扩散法;土壤速效磷含量的测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法;土壤速效钾含量的测定采用NH4OAc浸提、火焰光度法。

1.3.2 脐橙根系分析 主要测定指标包括根总长、根平均直径、根总面积、根总体积、根直径等级分布及根尖段长分布等根系形态信息。具体采用多功能根系扫描仪测定相应指标[15]。

1.3.3 土壤三大类群微生物数量测定 细菌、真菌、放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基平板混菌法、孟加拉红培养基平板混菌法、高氏1号培养基平板混菌法培养，并测定其数量[16]。

1.3.4 土壤微生物群落功能多样性的测定 称取10 g新鲜土样与100 mL生理盐水混匀后制备土壤悬液，置于三角瓶中，25 ℃、200 r/min 振荡10 min（摇床），稀释至10-3浓度梯度，用移液枪吸取150 μL接种于Biolog Eco微平板，25 ℃恒温培养7 d，每隔24 h使用多功能酶标仪读数（590 nm），通过计算获取平均颜色变化率（average well colourdevelopment，AWCD）[17]。

1.3.5 土壤细菌群落结构分析 土壤细菌16S特异区段建库测序：在试验12个月后，选择合格的根际土壤总DNA，使用16S小亚基核糖体片段的特异引物加接头及barcode的融合引物对总DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物通过试剂盒进行磁珠吸附回收，并使用LabChip GX（Caliper，美国）检测回收片段的大小及浓度，委托北京诺禾致源科技股份有限公司对柑橘根际的16S小亚基核糖体特异片段进行高通量测序。测序引物序列为：534f，5′-CCAGCAGCCGCGGTA AT-3′;783r，5′-ACCMGGGTATCTA ATCCKG-3′。

1.4 数据统计分析

试验测定数据采用Excel 2007 进行处理，采用SAS 10.0统计分析软件进行方差分析、显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同生草栽培对土壤基本理化性质的影响

由表1可知，与土壤本底相比，除土壤速效磷、速效钾外，生草栽培显著提高了脐橙土壤pH值、有机质含量、碱解氮含量。试验开始6个月后，与CK相比，脐橙土壤pH值、速效磷含量下降，SC4处理土壤有机质含量最高，显著高于SC2、SC1、CK、SC3处理，其增幅分别为38.86%、38.52%、34.12%、21.66%。试验12个月后，与试验6个月相比，各生草处理组土壤pH值、碱解氮、速效钾含量均下降，SC3、SC4处理土壤速效磷含量上升，其中SC4处理的土壤有机质含量显著高于SC1、CK、SC2处理，其幅度分别为50.12%、49.76%、49.03%，SC3处理的土壤有机质含量与SC4没有显著差异。试验结果表明，生草栽培有利于改善土壤环境。

2.2 生草栽培对纽荷尔脐橙根系生长的影响

由表2可知，随盆栽种植时间的推移，除根平均直径外，脐橙根总长、根表面积、根体积、根尖数均显著增加。试验开始6个月后，與幼苗根相比，SC4、SC3、SC2、SC1处理脐橙根总长、根表面积、根体积、根尖数均显著增加，其中SC4、SC3处理增加最显著。试验12个月后，与试验6个月相比，除脐橙根平均直径明显下降外，脐橙根总长、根表面积、根体积、根尖数均明显增加，其中SC4、SC3处理增加最明显。试验结果表明，生草栽培可以促进脐橙根系的生长发育。

2.3 生草栽培对纽荷尔脐橙土壤微生物数量的影响

由表3可知，生草栽培下，脐橙土壤微生物中细菌数量最高，放线菌数量最稳定。试验开始6个月后，SC2处理细菌数量最多，显著高于CK、SC1处理，其幅度分别为80.00%、28.57%;SC4、SC3处理细菌数量分别为3.3×105、3.2×105 CFU/g，且与SC2处理差异不显著。试验12 个月后，各生草处理土壤微生物数量与6个月时趋势类似，SC3处理细菌数量最多，显著高于CK、SC1、SC4处理，其幅度分别为76.19%、42.31%、19.35%，SC2与SC3处理差异不显著。试验结果表明，生草栽培下土壤微生物数量增加，且细菌数量增加最显著。

2.4 生草栽培对纽荷尔脐橙盆栽土壤微生物功能多样性的影响

由表4可知，试验开始6个月后，经过完全培养120 h后SC3处理的AWCD值最高，显著高于CK、SC1、SC2处理，其幅度分别为76.67%、29.58%、9.05%。试验12个月后，土壤样品经过完全培养120 h后，各处理的AWCD值与6个月时趋势类似，SC3处理的AWCD值最高，其次是SC4处理，分别为0.743和0.717。另外，随着培养时间的推移，各生草处理（SC1、SC2、SC3、SC4）土壤样品的AWCD值呈上升趋势（表4）。结果表明，生草栽培有利于提高AWCD值。

2.5 生草栽培对纽荷尔脐橙盆栽土壤根际微生物群落结构的影响

本试验采用Shanon-Wiener、ACE及PD-Whole-tree指数等表征土壤细菌的群落多样性，所有处理的测序深度（goods-coverage）均在0.98以上（表5）。高通量测序结果表明，SC4处理的Shanon-Wiener指数最高（9.74），显著高于CK、SC1处理及SC2处理，其幅度在9.56%～15.13%间;SC3处理的Shanon-Wiener指数为9.73，与SC4处理差异不显著。PD-Whole-tree指数是基于系统发生树来计算的多样性指数，与Shanon-Wiener指数类似，SC4及SC3处理的PD-Whole-tree指数较高，分别为224、231。但在本试验中各处理的ACE值则没有出现显著差异。

韦恩图（Venn图）可用于统计多个样本中所共有和独有的OTU数目，可以直观地表现环境样本的OTU数目及组成的相似性及重叠情况（图1）。在本试验中，CK、SC1、SC2、SC3及SC4的OTU数量分别为5 358、5 058、5 461、5 145及5 255，其中所有处理共有的OTU数量为2 768，分别占5组处理OTU总数的51.7%、54.7%、50.7%、53.8%及52.7%。值得注意的是，SC3处理中发现了605种独有的OTU，占该处理总OTU数量比例的11.8%，显著高于其他处理（CK、SC1、SC2、SC4）独有的OTU数量比例（7.6%、6.4%、6.0%、6.9%）。

3 讨论与结论

目前，果园生草栽培技术仍未被我国广大果农接受，一般认为，果园生草会影响果树的正常生长，降低果实的产量和品质[18]。其实不然，大量研究表明，生草栽培极大地改善土壤结构、提高土壤营养。段敏杰等研究表明，与清耕相比，枇杷园种植黑麦草3年后，果园土壤结构得到改善，土壤肥力显著提高，其中在0～20 cm土层，土壤有机质含量增加了22.4%[19]。土壤有机质不仅是土壤中各种营养元素（N、P等）的来源，还是土壤微生物生命活动的能源[12]。霍颖等研究也表明，果园行间种植白三叶、黑麦草、紫花苜蓿、鸭毛草等均能提高土壤有机质含量[20-22]。本试验结果表明，与裸露土壤相比，试验12个月后生草栽培下脐橙土壤pH值上升，土壤有机质、碱解氮含量显著增加，且无分隔处理SC4的有机质含量最高，尼龙袋分隔处理SC3与SC4差异不显著。这说明生草栽培可以提高土壤肥力，且草根本体及其分泌物均作用于脐橙土壤。碱解氮和速效钾含量均有所下降，说明百喜草在生长过程中消耗了大量的土壤养分，因此，需要对果园及时进行追肥，以免影响果树的生长发育。

一般认为，植物根系越发达、根表面积越大，则对土壤养分吸收能力越强。宋佳承等研究表明，间作生草显著提高了油橄榄根系活力和根系活跃吸收面积，且间作百喜草最佳[23]。惠竹梅等研究表明，葡萄园行间生草促进了葡萄根系生长，提高了土壤肥力，加强了葡萄根系对土壤养分的吸收[21]。这与本研究结果相似，生草栽培下，脐橙根总长、根表面积、根体积、根尖数等均显著增加，其中无分隔生草SC4和尼龙袋分隔生草SC3增加最显著，说明生草栽培能够促进脐橙根系的生长、提高根系活力。

果园土壤中微生物数量越多，越有助于土壤有机质的分解以及果树对土壤养分的吸收[13]，因此，研究土壤微生物的影响因素，对提高微生物数量、促进果树生长发育具有重要意义[24]。王倩等研究表明，生草栽培可显著提高微生物数量，且细菌数量最多[25]。这与本研究结果一致，生草栽培下，与裸露土壤CK相比，各生草处理微生物数量均显著增加，其中塑料盆分隔SC2处理细菌数最多，与无分隔处理SC4和尼龙袋分隔处理SC3差异不显著。土壤微生物功能多样性越高，土壤微生物对碳源的利用能力越强，土壤微生物的代谢活性越高。有研究表明，生草栽培显著提高了梨园土壤微生物对碳源的利用程度，增强了土壤微生物代谢活性[26]。本试验结果表明，经过完全培养120 h后的尼龙袋分隔处理SC3的AWCD值最高，其次是无分隔处理SC4的AWCD值，显著高于裸露土壤CK、无百喜草种植SC1、塑料盆分隔处理SC2，说明生草栽培后，脐橙土壤微生物的代谢活性显著增强，且主要受草根根系分泌物的影响。土壤微生物种群越丰富、数量越高，根系生态环境越活跃、越稳定[27]。另外，在本研究中采用无分隔处理SC4的Shanon-Wiener指数最高（9.74），显著高于CK、SC1及SC2处理，采用尼龙袋分隔处理SC3的Shanon-Wiener指数与SC4处理没有显著差异，PD-Whole-tree指数与Shanon-Wiener指数类似。说明生草栽培能够显著提高脐橙土壤微生物群落多样性，且在尼龙袋分隔处理SC3中发现了605种独有的OTU，占该处理总OTU数量比例的12.0%，显著高于其他处理（CK、SC1、SC2、SC4）独有的OTU数量比例。综上，这很大程度上是由于生草栽培改善了脐橙土壤微生物的生态环境，而百喜草的凋落物及其根系分泌物会给土壤微生物提供大量的营养物质，使得土壤微生物数量、组分和功能发生变化，进一步优化土壤微生物群落结构的多样性。

研究生草栽培对纽荷尔脐橙根系生长及土壤微生物群落影响的试验结果表明，生草栽培顯著提高了脐橙土壤有机质含量，改善了土壤理化性状，促进了脐橙根系生长发育。同时，也有利于脐橙土壤微生物数量特别是细菌数量的增加，并优化了土壤微生物群落结构的多样性，提升了土壤微生物功能多样性。科学的生草栽培模式有利于脐橙土壤的可持续利用能力的维持。

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