聚多巴胺纳米颗粒对结直肠癌细胞光热干预效果研究

陈融超　周连锁

1研究背景

结直肠癌（Colorectal Cancer）是世界上最高发的癌症类型之一，约占所有新癌症病例的10%和所有癌症死亡病例的8.5%。在中国，结直肠癌位居我国恶性肿瘤发病第三位，其发病率达28.2/10万，年发病数为38.8万例，且发病率呈上升趋势，死亡率为13.61/10万，年死亡数为18.7万例，在因恶性肿瘤致死原因中排行第五。结直肠癌治疗以手术为主，化疗和放疗为辅，但传统的手术切除带来的如吻合口出血、术后肠梗阻等并发症，很大程度上增加了患者的痛苦。同时，结直肠癌术后转移和复发的问题严重影响预后，转移是结直肠癌致死的最主要原因.约有50%的患者可出现肝转移，其中同时性肝转移达15%～25%。

光热治疗（Photothermal Therapy，PTT）是在临床上继手术、放疗和化疗之后的新兴治疗手段。其作为一种新型的利用光热转换剂吸收光能并产热来起到治疗效果的无创肿瘤治疗手段，对于治疗浅表性肿瘤具有良好的效果。该治疗方法最具优势的特点是无创，引起患者全身系统性损伤小、并发症少，光热治疗不仅能杀灭癌细胞，还可以抑制肿瘤细胞的转移，具有精确性高、可控性强、副作用小等特点。光热转换剂是光热治疗中的关键性材料.理想光热转化剂应具有以下特点：（1）在近红外光窗口（650～950nm）具有较强的吸收能力和较高的光热转换效率;（2）生物安全性高;（3）生物稳定性强;（4）在恶性肿瘤组织中保留时间长。其中，聚多巴胺是一种较为理想的光热转化剂。聚多巴胺是黑色素的主要成分，具有较广的光谱吸收性、光热转化效率高、生物相容性优异，在体内可降解等特点，非常适合用于光热治疗。本研究利用聚多巴胺对结直肠癌SW480、SW620细胞进行光热干预，以探索其对结直肠癌的治疗效果。

2研究方法

2.1材料

聚多巴胺纳米颗粒由本实验室进行合成，完全培养基（DMEM高糖培养基（hyclone）、MTT、青霉素、链霉素、胎牛血清（FBS）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。胎牛血清（FBS）购买于浙江天杭生物科技股份有限公司。人结直肠癌细胞SW480、SW620由空军军医大学提供。

2.2 MTT法检测聚多巴胺对SW480、SW620细胞的毒性

采用复苏的人结直肠癌细胞SW480、SW620为样品，在含10%胎牛血清、浓度为0.1mg/mL的青霉素和链霉素的DMEM培养基中进行培养，并将其放置于条件为37℃，5%CO，的无菌培养箱中进行培养，定期观察细胞生长状况。在细胞长至铺满培养皿80%以上后进行传代。将传代后培养36h左右的细胞用胰酶消化，以每孔1×10⁴个细胞的密度铺入平底96孔板内，加入含有不同浓度梯度聚多巴胺纳米颗粒的培养基（81，27，9，3，1μ/mL），继续培养96h。培养结束后去除培养基，每孔重新加入200μL含有浓度为100ng/mLMTT的完全培养基，并培养4h。去除培养基后，每孔加入100mL DMSO，放置于水平振荡仪上振荡处理10min后利用酶标仪测定每孔在490nm处的吸光值。计算IC₅₀值。

2.3聚多巴胺光热干预效果检测

2.3.1不同浓度的聚多巴胺光热剂干预效果检测

将人结直肠癌细胞SW480、SW620铺至24孔板，1×10⁵个/孔，分为5组，第1组为空白对照组，2～5组分别加入不同浓度的聚多巴胺光热剂（200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL），采用照射功率为1W/cm²，激光波长为808nm的激光发射器照射处理6min。辐照完毕后继续孵育12h，去除孔内的培养基，参照前述MTT法测定抑制率。根据前期所确定的聚多巴胺的最适药物浓度.设置不同的辐照时长和辐照功率，间隔时长与功率分别为2min以及0.4W，以前述同样MTT法测定并计算抑制率。

2.3.2不同辐照时间干预效果检测

在2块24孔板内分别均匀铺人人结直肠癌细胞SW480、SW620，密度为1×10⁵个/孔，分为5组，第1组为空白对照组，不进行照射。第二组照射时长为1min，第三组照射时长为2min，第四组照射时长为3min，第五组照射时长为4min，第六组照射时长为5min。每孔加入1mL浓度为100μm/L的聚多巴胺光热剂。第二至六组每孔均以808nm的激光进行照射处理，照射功率为1W/cm²。照射完毕继续孵育12h，以前述同样MTT法测定并计算抑制率。

2.3.3不同辐照功率干预效果检测

在2块24孔板内分别均匀铺入人结直肠癌细胞SW480、SW620，密度为1×10⁵个/孔，分为5组。设置第1组为空白对照，第2～6组辐照功率分别为0.2w/cm²、0.6W/cm²、1.0W/cm²、1.4W/cm²、1.8w/cm²。每孔加入1mL含有100μg聚多巴胺光热剂的无色培养基。使用波长为808nm的激光发射器，在上述不同功率下对第2～6组进行2min的照射处理。处理后放回培养箱孵育12h，以前述同样MTT法测定并计算抑制率。

3结果

3.1聚多巴胺对SW480、SW620细胞增殖的抑制效果

聚多巴胺针对SW480、SW620细胞未显示出抑制效果，其在SW480、SW620细胞上的IC₅₀值均超过500μg/mL。表明了聚多巴胺在非光照条件下具有毒性低的特点，生物安全性高。

3.2聚多巴胺对SW480、SW620细胞的光热干预效果

在同等光照功率和时长下，聚多巴胺的浓度越高，细胞存活率越低。最高浓度处理组细胞存活率低于10%，最低浓度组70%细胞存活，同等药物浓度和光热下SW480、SW620细胞存活率未显示出显著的差异。该结果证明了细胞存活率与聚多巴胺纳米粒子浓度之间存在着显著的量效关系，表明了聚多巴胺具有较好的光热转换特性.能将光能很好的转化为热能。并且其发热抑制肿瘤效果明顯，对细胞杀伤作用随浓度的升高而增大。

根据前面结果，选出100μg/mL的聚多巴胺进行光辐射时长测试。细胞存活率与光辐射时长之间存在着显著的量效关系，光辐射时长越长，细胞存活率越低。照射10min后细胞仅有9.7%的存活率，且状态很差。同等条件下仅进行光辐射的SW480、SW620细胞存活率没有显示出显著的差异。随时间的增加，聚多巴胺能更好地将吸收的光能转化为热能，从而进行细胞杀伤。

细胞存活率随着光辐照功率的增加在一定范围内逐渐降低，超过1.4W/cm²后未发现显著存活率差异。

4讨论

目前结直肠癌多采用手术、化疗和放疗等进行综合性治疗，但这些治疗方法均有其局限性。手术具有较大的损伤性，术后并发症以及肝转移对患者存在着较大的威胁，其中，转移病灶切除不彻底、只能行姑息性辅助化疗等情况依旧存在：而化疗效果则受毒性和耐药性所限制;外放射疗法在初次进行手术后可有效降低其复发率，但行肝切除术后，受个体差异以及放射剂量等因素影响，肝脏仍可产生如腹水、肝大等并发症，导致患者预后较差，生活质量较低等问题。纳米材料介导的光热治疗已成为一些不可切除的实体瘤的替代疗法，其作为一种无创的治疗手段，具有明显的肿瘤治疗优势，较强的可控制性可以降低系统毒性并极大减少对正常组织的损伤，可极大地减少患者的痛苦，提高生活质量。多巴胺作为黑色素的组成成分在人体内大量存在，而聚多巴胺纳米颗粒是人工合成黑色素样纳米颗粒的出色代表，其安全性和光热转换效能已被广泛认可。利用聚多巴胺纳米颗粒进行光热治疗，在肿瘤治疗方面具有广阔的临床研究前景。

本实验通过制备的聚多巴胺纳米颗粒对结直肠癌细胞进行光热干预研究。研究结果表明，聚多巴胺可有效抑制结直肠癌细胞SW480、SW620的增殖。聚多巴胺纳米颗粒在非光热照射条件下毒性极低，而在光热照射条件下显示出对细胞的杀伤作用，且光热杀伤效果随时问和聚多巴胺纳米粒子浓度的升高而增加，合适的光辐射时间和药物浓度可使聚多巴胺将所吸收的光能充分转化成可杀伤肿瘤细胞的有效热能。实验表明聚多巴胺对结直肠癌有明显的干预效果，并且充分展示了聚多巴胺的高生物安全性、高光热转化能力、高光热转化效率以及可控性，该研究结果可为日后的结直肠癌临床治疗新方法提供有效的参考。