桃红化浊丸对CCl4致肝纤维化模型大鼠的影响*

郝建梅，毛明华，吕生霞，陈香妮，袁超，石磊，杨震

西安市中医医院，陕西 西安 710021

肝纤维化是肝脏的常见疾病之一，慢性肝炎发展为肝硬化的过程中常常伴随有肝纤维化［1－3］。在慢性肝脏损伤过程中，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分泌增加和（或）降解减少，ECM大量沉积可能会导致肝纤维化［4－5］。桃红化浊丸临证60余年，是治疗湿热伤肝病证的经验方［6－8］。前期临床研究表明，其抗肝纤维化疗效显著，已形成院内制剂，长期临床医疗实践表明，该药疗效确切，且未见明显不良反应发生，是治疗肝纤维化的有效方药。为探究其作用机制，课题组将探讨其与Smad3、金属蛋白酶组织抑制因子－1（the tissue inhibitor of metalloproteinases－1，TIMP－1）蛋白及其基因和miRNA29b的关系，从而揭示桃红化浊丸对肝纤维化的作用机理，形成清热化湿、疏肝健脾、活血通络法治疗本病的诊治规范，为以后的新药研发奠定基础。

1 材料

1.1 动物健康SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2019－003，伦理号：2019－1358，体质量180～220 g，饲养温度：（22±1）℃，湿度：50%～70%，换气次数：15～20次·h－1，气流速度：0.1～0.2 m·s－1，光照：150～200 Lx，12 h明暗交替，自由摄取水和食物。

1.2 药材及试剂桃红化浊丸由西安市中医医院提供；RNAiso Plus（上海善然生物科技有限公司，批号：9108）；RNA逆转录试剂盒（北京康润诚业生物科技有限公司，批号：8BC01）；StarScriptⅡcDNA第一链合成试剂盒－Ⅱ（北京康润诚业生物科技公司，货号：A214－10）；预混实时荧光定量快速PCR反应体系（北京康润诚业生物科技公司，货号：A301－05）；RIPA裂解液（西安赫特生物技术有限公司，WB053）；Smad3、TIMP－1抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号分别为：66516－1－Ig、16644－1－AP；β－肌动蛋白（β－actin）单克隆抗体（美国CST公司，货号：3700）。

1.3 仪器F6／10型手持式高速离心机（上海净信实业发展有限公司）；PowerPacTM型电泳仪电源（美国Bio－Rad公司）；Trans－blot型转印槽（美国Bio－Rad公司），CFX ConnectTM型PCR仪（美国Bio－Rad公司）；5424R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Genegnome XRQ型专业化学发光成像系统（中国基因有限公司）；DS－11型超微量分光光度计（中国倍辉科技有限公司）。

2 方法

2.1 动物模型的复制与分组40只大鼠，随机选10只为空白组，其余大鼠采用腹腔注射体积分数为40%的CCl4复制大鼠肝纤维化模型［9］，一周注射2次，连续2周。将造模成功的大鼠随机分为模型组、秋水 仙 碱（0.5 mg·kg－1）组、桃 红 化 浊 丸（1.54 g·kg－1）组，每组10只大鼠，在模型成功1周后，给予相应的药物进行灌胃，连续给药6周。

2.2 Western Blot检测大鼠肝脏Smad3、TIMP－1蛋白表达每组随机选择5只大鼠，用戊巴比妥钠麻醉后，取大鼠的肝脏，称重后加入蛋白裂解液匀浆，离心后取上清液，测定蛋白浓度后，变性。电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影。参照蛋白为β－actin［10－11］。

2.3 RT－PCR法检测大鼠肝脏miRNA29b、Smad3mRNA和TIMP－1mRNA表达每组随机选择5只大鼠，用戊巴比妥钠麻醉后，取大鼠的肝脏，称重后加入RNAiso Plus提取总RNA。逆转录时加入1μg的RNA样品、Primer Script RT Master Mix和无RNase水至10μL，轻轻摇动使其均匀混合，然后进行逆转录反应，反应后采用两步法进行PCR反应，反应条件：预变性在95℃下反应2 min，变性在95℃下反应15 s，退火／延伸在60℃下反应30 s，共40个循环［12－14］。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.4 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计分析。以平均数±标准误（±s）用于表示数据结果，单因素方差分析及t检验用于组间进行比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 桃红化浊丸对大鼠肝脏Smad3、TIMP－1蛋白表达的影响与空白组比较，模型组大鼠肝脏Smad3、TIMP－1蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与模型组比较，桃红化浊丸组Smad3、TIMP－1蛋白表达下调（P＜0.01）。见图1、图2。

图1 大鼠肝组织中Smad3、TIMP－1蛋白表达

图2 大鼠肝组织中Smad3、TIMP－1蛋白表达

3.2 桃红化浊丸对大鼠肝组织中Smad3、TIMP－1mRNA和miRNA29b表达的影响与空白组比较，模型组大鼠肝组织miRNA29b水平明显降低（P＜0.05），Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，桃红化浊丸组和秋水仙碱组大鼠肝组织miRNA29b水平明显升高（P＜0.05），Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平明显降低（P＜0.05），见表2。

表2 桃红化浊丸对大鼠肝组织中Smad3、TIMP－1 mRNA和miRNA29b表达的影响 （±s）

表2 桃红化浊丸对大鼠肝组织中Smad3、TIMP－1 mRNA和miRNA29b表达的影响 （±s）

注：与空白组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05

组别 n miRNA29b Smad3 mRNA TIMP－1 mRNA空白组 5 1.0024±0.0846 1.0124±0.186 1 1.0029±0.0930模型组 5 0.283 7±0.034 6＃2.073 3±0.224 7＃1.627 6±0.273 2＃秋水仙碱组 5 0.467 7±0.039 5*1.473 1±0.107 5*1.241 7±0.089 9*桃红化浊丸租 5 0.508 6±0.094 7*1.623 2±0.302 3*1.257 4±0.123 1*

4 讨论

肝纤维化多属于中医学“胁痛”“积聚”“肝痹”等范畴，对肝纤维化的病因病机认识，大多数医家均认同其发病为湿热疫（虫）毒之邪侵扰机体，机体正气不足、正不敌邪、邪气踞之而损伤机体，导致气血痰瘀交杂，脏腑气血阴阳失调。湿毒、痰浊、瘀血与正气亏损贯穿肝纤维化发展全过程［15］。检索国内外有关中医药诊疗乙型肝炎肝硬化文献发现，对乙型肝炎肝硬化证候分布进行统计，（不含兼夹证）湿热内蕴排在首位［16］，可见湿热在肝纤维化中的作用。

本课题组杨震教授在临床肝病的辨治中创新性应用朱丹溪“相火论”的观点，把肝病所产生的局部内生火热按病理相火这一理论去研究，提高了对肝病病机的认识。根据自己治疗肝病的体会，对肝病临床诊治，按疾病的发展过程将病理性相火分为六型：郁热相火、血热相火、湿热相火、瘀热相火、阴虚相火、相火虚衰。认为肝病迁延反复，加之肝病必然乘脾，脾失健运则易出现肝郁夹湿、郁久化热，而形成湿热相火之证。病机特点为肝郁乘脾、湿滞化热。湿热是病因，肝脏是病位，调治时应紧紧抓住肝郁与湿滞这一对主要矛盾，疏肝时应注意不要耗气伤阴，化湿时不要寒凉滞脾。临床对肝病中的湿热相火，强调治法不宜用丹溪的苦寒泄火法，而应用温病学家治湿的理论，来指导湿热伤肝的证治，利湿而不伤阴、清热而不助湿，宜用芳香化浊、辛开苦降之法。临床自拟“桃红化浊汤”，方中用藿香、佩兰叶、香薷芳香化浊以醒脾困，青皮、郁金理气疏肝以解肝郁，薏仁、茯苓健脾化湿以健脾运，茵陈、白茅根、板蓝根清热利湿以清相火，桃仁、红花疏通肝络以防瘀结，兼作引经以清血分湿热。

全方疏肝健脾、清热利湿、活血通络，标本兼顾，从根本上纠正虚实偏颇［17］。桃红化浊丸用于中医证属湿热瘀阻型的肝纤维化患者，临床疗效显著［18］。本课题采用桃红化浊丸治疗肝纤维化，并通过现代科学技术揭示其治疗肝纤维化的机理，为肝纤维化患者提供一种效优价廉的治疗用药。

miRNA是一种单链RNA，它能调节机体多种生物过程［19］。研究表明，miRNA29b能负向调节纤维化蛋白，抑制机体纤维化［20－21］。Smad3是转化生长因子β1（TGF－β1）的下游因子，TGF－β1是一种纤维化因子，可以激活Smad3导致肝纤维化的发生［22－23］，TGF－β1／Smad3信号通路在肝纤维化进程中起到重要作用。肝纤维化的主要特点是细胞外基质ECM的集聚，ECM的降解需要蛋白酶水解，TIMP－1与肝纤维化密切相关［24］，许多研究都表明中药通过调节TIMP－1水平来治疗肝纤维化［25－27］。本研究发现，与模型组比较，桃红化浊丸组能明显下调大鼠肝脏Smad3、TIMP－1蛋白表达，升高miRNA29b水平，降低Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平。明确了桃红化浊丸可能通过影响miRNA29b表达，从而降低Smad3、TIMP－1蛋白和基因的含量，可能是其防治肝纤维化的机制及生物学效应，为后期科学阐释桃红化浊丸的作用机制提供了依据。