一株鹌鹑源鸡毒支原体的分离鉴定

刘丽萍 李玉杰 路晓 赵巧雅 盛媛 高月花 郭效珍 胡峰 田野 刘存霞 于可响

摘 要：本研究从发病鹌鹑体内分离出1株支原体，通过菌落形态、pvpA基因的PCR扩增与测序分析，鉴定为鸡毒支原体。采用6种抗菌药物测其最小抑菌浓度（MIC），发现该分离株对泰妙菌素最敏感，MIC达0.00625 μg/mL;其次为酒石酸泰乐菌素、盐酸强力霉素，对大观霉素、庆大霉素、卡那霉素的敏感性较差。

关键词：鸡毒支原体;鹌鹑;pvpA基因;最小抑菌浓度

中图分类号：S858.39        文献标识码：B        文章编号：1673-1085（2021）8-0041-04

鸡毒支原体（Mycoplsma gallisepticum，MG）又称为鸡败血支原体、鸡毒霉形体，宿主谱较广，鸡、鹌鹑、火鸡等包括野生鸟在内的10多种禽类均可感染，但主要感染鸡和火鸡，感染鸡而引起鸡的慢性呼吸道病（chronic respiratory disease，CRD），感染火鸡而引起火鸡的传染性窦炎（infectious sinusitis）^[1，2]。该病广泛分布于世界各地，致死率不高，但会导致家禽产蛋率、孵化率和饲料转化率降低。临床上常常继发或并发于新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、大肠埃希氏菌病等传染病，导致病情加重，死亡率升高，为家禽养殖带来很大的经济损失^[3]。

鹌鹑感染支原体主要表现为呼吸道症状，如鼻腔内有分泌物，鼻窦肿胀，有粘性和脓性液体，喉头和气管内有粘液，气囊增厚、浑浊，气囊间有泡沫样粘稠液体和黄色干酪样物^[4]。本试验从发病鹌鹑中分离到一株鸡毒支原体，并测定了分离株的药物敏感性，以期为临床给药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 支原体培养基 本研究采用改良Frey氏培养基，购买自北京中海生物科技有限公司。

1.1.2 菌株及病料 鸡毒支原体标准株PG31;鸡毒支原体SD株，由山东省农业科学院家禽研究所保存。

病料：来自2020年12月山东发生气囊炎的某鹌鹑厂，无菌取病鹌鹑气管及肺。

1.1.3 抗菌药物 盐酸强力霉素（S17064，上海源叶生物）、泰妙菌素（S24754，上海源叶生物）、酒石酸泰乐菌素（S30996，上海源叶生物）、盐酸大观霉素（S7013，上海源叶生物）、庆大霉素（S17024，上海源叶生物）、硫酸卡那霉素（25389-94-0，Ruitaibio）。

1.2 方法

1.2.1 病原核酸检测 将鹌鹑气管及肺按1︰5（W/V）比例加入磷酸盐缓冲液（PBS）碾磨，取碾磨液提取核酸，进行支原体、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒的检测。检测引物见表1。

1.2.2 支原体分离培养及形态观察 参考之前的资料^[5，6]，无菌条件下采集鹌鹑气管及肺，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），碾磨后静置，取上清加入到改良Frey氏液体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱培养，观察约5～7 d，待液体培养基由红色变为橙黄色为培养终点。将培养液接种于固体培养基后，37 ℃恒温培养箱培养5～7 d，即可得支原体菌落。低倍镜下观察菌落形态，挑取低倍镜下呈“荷包蛋”样菌落接种于液体培养基培养3～5 d，待培养基变黄后接种于支原体固体培养基，挑单菌落再接種于液体培养基，重复三次，获得支原体纯培养物。

1.2.3 鸡毒支原体PCR鉴定 根据NCBI中发表的鸡毒支原体pvpA基因序列设计一对特异性引物，MG-F：5-AGAATGCTCATCCAGGTCAAC-3，MG-R：5-GGTGTAGACCATTTGGCATTG- 3，预期扩增产物大小为330 bp。PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min。产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行核酸比对。

1.2.4 颜色改变单位（CCU）测定 将支原体纯培养物连续传代，待稳定传代后将菌液置于-80 ℃保存备用，参考吴清民^[7]的方法进行活菌浓度测定。首先将改良Frey氏液体培养基分装于灭菌离心管，1.8 mL/管，共11管，取分离菌液0.2 mL加入离心管中，混匀后取0.2 mL加入到第二管，将培养菌液进行10倍梯度稀释，一直稀释至第10管，第11管作为支原体培养基对照，密封好，于37 ℃恒温培养箱中，每天观察试管的变色情况。待培养基颜色不再发生变化时，培养基颜色由红色变为黄色的最高稀释的试管数就作为待测菌液的颜色改变单位，用CCU/mL来表示支原体的活菌浓度。

1.2.5 药物最低抑菌浓度（MIC）测定 参考之前的资料^[8]，采用微量稀释法对6种抗菌药物进行MIC测定。取96孔细胞培养板，每一排为1组。所有孔中加入100 μL支原体液体培养基，于第1排中加入上述稀释并除菌的药液，充分混匀后取100 μL加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔后弃掉多余的100 μL。每排的第1～10孔中各加100 μL稀释至1×10⁴CCU/mL的菌液。第11孔加100 μL支原体液体培养基作为培养基对照（阴性对照），第12孔加100 μL稀释至1×10⁴CCU/mL支原体菌液作为支原体生长对照（阳性对照）。密封细胞板，37 ℃恒温培养箱培养1周，观察试验结果。当阳性对照变成黄色，阴性对照不发生颜色变化时，记录试验药物颜色变化的孔数，该药物浓度即为MIC。同时采用相同方法，选取泰妙菌素、酒石酸泰乐菌素、强力霉素3种药物，检测MG阳性菌株SD株和标准株PG31株的MIC。

3 结果

3.1 病原核酸检测

核酸检测结果显示，只有鸡毒支原体PCR结果为阳性，其它病原PCR结果为阴性，排除了其它呼吸道病原感染的可能。

3.2 分离培养

从发病鹌鹑体内分离到一株支原体，在液体培养基中培养3～5 d，培养基颜色由玫红色变为橙黄色，稳定传代后24 h可变为橙黄色，阴性对照不变色。在固体培养基上培养3～5 d，培养基表面有针尖大小、透明、光滑菌落，低倍镜下观察似“荷包蛋”样，如图1。

3.3 PCR鉴定

将分离到的支原体进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳分析，得到1条约330 bp大小的目的条带，与预期结果一致。扩增产物测序后，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，发现其与鸡毒支原体的同源性最高，在87.85%～98.44%之间，说明该分离株为鸡毒支原体，并将其命名为MG1203。

注：M：DL2000 Marker;1：支原体分离株;2：滑液囊支原体;3：鸡毒支原体阳性对照;4：空白对照。

3.4 药物MIC测定

选用6种抗菌药，分别测定MIC，结果见表2。该分离株对泰妙菌素最敏感，MIC达0.00625 μg/mL，其次为酒石酸泰乐菌素、盐酸强力霉素，对大观霉素、卡那霉素、庆大霉素的敏感性较差。相比较SD株和PG31株，分离株MG1203对泰妙菌素、酒石酸泰乐菌素、盐酸强力霉素的MIC均升高。

4 讨论

支原体、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒等都会引起的鹌鹑呼吸道疾病，临床上很难鉴别。化验结果表明此次鹌鹑发病为支原体引起的。

禽支原体感染在全世界范围内广泛存在，主要包括鸡毒支原体感染和滑液囊支原体感染，这两种支原体不仅能感染鸡，也能感染其他禽类。本试验从发病鹌鹑中分离到一株支原体，在改良Frey氏液体培养基中生长能使培养基颜色变黄而不浑浊，在固体培养基上长出“荷包蛋”样菌落，完全符合支原体生长特性。禽支原体pvpA基因编码的PvpA蛋白属于MG的一个粘附因子，该蛋白是一整合于禽支原体膜上的可变蛋白，在不同株系间大小不同，常用于鉴别不同种类的支原体。因此，本试验根据鸡毒支原体的pvpA基因序列设计了一对特异性引物，对分离株进行扩增与测序，经比对，发现该分离株为鸡毒支原体。

目前，药物防治仍是控制支原体感染的主要手段，但是抗生素的滥用也导致了耐药性的产生。相比较本实验室保存的鸡毒支原体SD株和PG31标准株，本文分离的鹌鹑源MG1203对泰妙菌素、酒石酸泰乐菌素、盐酸强力霉素的敏感性显著降低，表明MG1203对这3种药物产生了耐药性，这可能与临床常用这些药物治疗支原体病有关。与之前报道相比较^[9]，MG1203对酒石酸泰乐菌素的MIC明显升高，对泰妙菌素的MIC差异不大，而对盐酸强力霉素的MIC降低。因此，及时进行药物敏感性试验才能更好的指导临床用药。本试验采用更敏感、可量化的最低抑菌浓度（MIC）试验对6种常见抗菌药物进行敏感性试验，发现该分离株对泰妙菌素敏感性最高，可用于临床治疗。

参考文献：

[1] Johnson D C， Emory W H， Kleven S H， et al. A Mycoplasma gallisepticum epornitic in turkeys： its epidemiology and eradication[J]. Avian diseases， 1981： 1047-1052.

[2] W calnek， H John Barnes. Disease of poultry[M]. tenth edition. Ames： Iowa state university press， 1997： 235-296.

[3] 王育伟，岳华，张晓晖，等. 鸡毒支原体研究概况[J]. 动物医学进展，2016，37（7）：106-110.

[4] 王金合，王卫东，杨景. 鹌鹑支原体与大肠菌混合感染诊治[J]. 甘肅畜牧兽医，2012，42（03）：27.

[5] 刘玲，管凤霞，黎敏，等. 二株禽支原体的分离与鉴定[J]. 山东畜牧兽医，2010，31（4）：17-18.

[6] 郤翠仙，朱天乐，陈合适.鸡毒支原体的分离鉴定及药线试验[J].中国畜牧兽药，2011，38（2）：172-174.

[7] 吴清民，杨秀玉，沈志强，等. 鸡毒支原体的分离鉴定和最低抑菌浓度测定[J].中国预防兽医学报，2003，25（4）：71-74.

[8] 丁美娟，卢凤英，严鹏，等. 鸡滑液囊支原体不同地区分离株对抗菌药物的敏感性试验[J]. 中国兽药杂志，2015，49（10）：52～55.

[9] 吴春琳，黄宝钦，蓝天韵，等. 福建白羽肉鸡鸡毒支原体的分离鉴定及最小抑菌浓度测定[J]. 中国畜牧兽医，2021，48（4）：1489-1497.

收稿日期：2021-07-05

作者简介：刘丽萍（1989-），女，汉，山东高密人，研究实习员，研究生，从事禽病诊断与防控，E-mail：liulping0114@sina.com。

*通讯作者：于可响（1979-），男，汉，山东青岛人，副研究员，从事禽病诊断与防控，E-mail：yukx1979@163.com。

将鸡蛋加热后，会发生什么？

鸡蛋分成蛋黄、蛋清和蛋壳三层。蛋黄凝固的温度为68～71℃，蛋清凝固的温度为62～64℃，煮鸡蛋时如果火太大，在蛋黄外面，凝固温度低的蛋清就会迅速凝固并且变硬，从而阻碍热量继续向蛋黄内传递，影响凝固温度较高的蛋黄凝固，使煮出来的鸡蛋清熟黄不熟。因此鸡蛋应该冷水下锅，慢火升温，沸腾后微火煮3～5 min，停火后再浸泡5 min。这样煮出来的蛋清嫩，蛋黄凝固又不老，蛋白变性程度最佳，也最容易消化。而煮沸时间超过10 min的鸡蛋，不但口感变老，维生素损失大，蛋白质也会变得难消化。

但是如果煮沸数个小时甚至时间更长，鸡蛋会发生什么样的变化呢？鸡蛋会被煮的过分成熟，蛋壳破碎，内容物变成糊状物质。

鸡蛋中充满了卷曲的蛋白质分子，加热后的蛋白质变性，结构发生变化，形成一个三维结构晶格。继续加热鸡蛋，蛋白质继续形成交联，使鸡蛋内部变得更加坚硬，蛋清也会释放出硫化氢，这也是为什么煮过的蛋在蛋黄上也有绿色的薄膜。虽然蛋壳足够坚固，可以在沸水中坚持一段时间，但不可能永远存在。

Deb-El Foods公司的食品科学家Shelly McKee表示：“鸡蛋的内部结构受到蛋壳和几层膜的保护，但是如果花足够长的时间（几个月）加热，蛋壳或许就承受不了其中存在的物理或化学变化，最终导致鸡蛋破裂，形成糊状物。但是这些都取决于加热的时长、蛋壳的变化和加热所用水的水质。”

（转自《蛋品世界》）