基于GC-MS的玉米萌发过程代谢组学研究

王玮棋， 牟美睿， 杨仁杰， 刘海学

(1.天津农学院农学与资源环境学院， 天津 300384； 2.农业农村部环境保护科研监测所， 天津 300191；3.天津农学院工程技术学院， 天津 300384)

玉米是我国三大粮食作物之一，产量仅次于水稻和小麦[1]，是重要的粮食经济作物，也是一种健康的粗粮作物[2]，营养丰富。而在直接食用的过程中大部分营养元素不能被人体直接吸收，蛋白质等物质利用率较低[3]，需要配合多种酶分解利用。种子作为植物生命的起点[4]，其萌发过程对作物生长至关重要。目前在全球种子市场中，每年约有60亿欧元的损失来自种子的发芽损失[5]。徐广海等[6]研究表明，萌发过程中代谢活动旺盛，可以提高生物酶活性，从而增强玉米营养价值。Chavan和Kadam[7]发现，萌发可以促进玉米的蛋白质利用率，同时可以降低玉米的抗营养因子水平。种子在萌发过程中通过吸水激活新陈代谢、转移储备物质、产生能量，从而开始蛋白质合成(翻译)并产生营养物质[9]，并且需要多条代谢途径配合，如糖酵解途径、三羧酸循环和戊糖磷酸途径等。种子萌发的代谢过程对种子活力(发芽)及植物生长发育至关重要，逐渐成为评价植物品质的重要标准[10]。

20世纪80年代以来，对种子萌发代谢过程基本原理的认识逐渐增加，但与基因组学或蛋白质组学相比，对种子萌发的代谢组学及生物标志物方面的研究还不够全面，同时对玉米种子萌发的研究主要集中在种子萌发的生理变化、营养成分及遗传机制方面[11-13]，对萌发过程的代谢过程研究较少。因此，本研究以玉米为试验材料，利用气相色谱质谱联用技术测定种子不同萌发阶段的相关代谢产物，明确种子不同萌发阶段的代谢物差异，研究萌发阶段的代谢物动态变化及代谢调控，试图进一步探索玉米种子萌发过程中营养物质的吸收变化规律，为进一步提高玉米粮食品质及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用华农138玉米种子为供试材料，由天津农学院农业分析测试中心提供。

1.2 试验设计

按照GB/T 3543.4—1995标准萌发试验规程，选取籽粒饱满的玉米种子，用5%次氯酸钠浸泡15 min，去离子水冲洗3次后采用纸培法置于发芽盒中，置于恒温培养箱中进行发芽试验，于8 h(A)、36 h(B)、80 h(C)、108 h(D)分别取样液氮冷冻，保存于-80 ℃冰箱中待测，3次重复。

1.3 试验方法

1.3.1样品制备

将玉米样品经液氮冷冻后研磨至粉末，称取150 mg加入体积比为1∶1∶1的乙腈-异丙醇-水混合溶液，超声提取35 min(40 kHz，4 ℃)后10 000 r·min-1离心1 min，取上清液100 μL氮气吹干。

1.3.2衍生化处理

取10 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液(40 mg·mL-1)加入样品中置于30 ℃恒温90 min后，向样品中加入30 μL衍生剂(MSTFA+1%TMCS)置于37 ℃恒温30 min，最后加入1 mL溶剂正庚烷(含20 μg·mL-1内标物十一烷)过0.22 μm滤膜，转入GC进样瓶待上机。

1.3.3GC-MS测定

试验仪器采用美国Aglient公司7890 A-5975 C型气相色谱质谱联用仪。

气相色谱条件：色谱柱为HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管气相色谱柱。载气为纯度99.999%的氦气，进样模式不分流，进样量1 μL。进样口温度250 ℃，升温程序为先由常温升至60 ℃维持1 min后，以10 ℃·min-1速度升至280 ℃，最后在280 ℃维持5 min。

质谱条件：电子碰撞内能为70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟4.5 min；扫描速度为2 scan·s-1，范围为50～500 m·z-1。

1.4 数据处理

通过GC-MS光谱全波段扫描玉米种子代谢物质，Agilent-MassHunter工作站对原始数据进行特征提取，最后得到保留时间(rt)及峰面积(intensity)；导出数据至Microsoft Excel进行整理，通过SIMCA-P进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)，SPSS进行t检验(Student’s t-test)，筛选差异代谢物，利用Omicshare平台进行聚类热图分析(HCA)、利用Metabo Analyst平台进行KEGG代谢通路分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析及差异代谢物鉴定

2.1.1GC-MS分析

对不同萌发阶段的玉米种子进行GC-MS分析，通过总离子流图(图1)可以看出，4份玉米材料中共扫描出116个峰，出峰时间集中在14～28 min之间，经数据库注释后，4份玉米种子材料中共得到56个代谢物，如图2所示，包括19种有机酸、12种氨基酸、15种糖及衍生物和10种化合物。在有机酸和糖及衍生物中，随着发芽时间的增加代谢物的含量及数量均表现为上升趋势，即D>C>B>A，其中糖类变化最明显，D较A处理含量增加了134%；在氨基酸中，B代谢物数量为A的67%，总含量仅为A的38%，而A、C、D在总体上均表现为依次上升趋势，即D>C>A>B；在其他化合物中，随着萌发阶段的变化，含量表现为C>A>D>B，而数量变化则表现为C>D>A>B。虽然氨基酸及化合物类物质含量呈不规律变化，但代谢物总变化仍表现为代谢物含量及数量随着萌发时间的增加而增加，对比萌发初期，其他萌发阶段代谢物含量均在一定程度上有积累。

2.1.2差异代谢物鉴定

为鉴别玉米籽粒不同萌发阶段的差异代谢物，对代谢物含量归一化处理后进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得到PLS-DA得分图(图3)，R2=0.984，Q2=0.997，同时为防止模型过拟合进行交叉验证后所有点均小于原始R2，说明模型拟合较好且具有可行性。通过得分图可以看出，该方法能较好的将不同萌发阶段的玉米籽粒区分开，进而得出投影变量投射重要度(Variable Importance for the Projection，VIP)(图3)，图中柱子高度越高差异越显著[14]，结合PLS-DA与方差分析(one-way ANOVA)筛选差异代谢物(VIP>1且p<0.05)[15]。最终得出15种差异代谢物(表1)，分别为有机酸(6种，40%)、氨基酸(4种，27%)、糖类及其衍生物(1种，6%)、其他化合物(4种，27%)。

表1 玉米不同萌发时期差异代谢物

2.2 差异代谢物分析

2.2.1差异代谢物聚类分析

利用Omicshare软件根据代谢物含量鉴定筛选出的差异代谢物，对不同萌发阶段玉米籽粒进行代谢物和萌发阶段两个维度的聚类热图分析(HCA)，如图4所示，横坐标代表不同萌发阶段，纵坐标代表差异代谢物，其中红色表达代谢物显著上调，相应蓝色代表显著下调，图中A、C、D聚在一支，其中A较D存在更多有机酸类物质的积累，C较A、D存在显著的醋酸及胆固醇积累。与其相比B中可以观察到显著上调的糖、有机酸和氨基酸的积累，说明筛选出的差异代谢物能将不同萌发阶段的玉米籽粒区分开来，同时不同萌发阶段的差异代谢物经过聚类也能明显区分，说明不同代谢物在响应不同萌发阶段途径上存在显著差异。

2.2.2差异代谢物含量变化

碳水化合物、蛋白质和脂肪类物质作为种子中的重要组成部分，其代谢产物糖类、有机酸、氨基酸分别在代谢过程中发挥重要作用。通过对不同萌发时期种子中不同差异代谢产物进行分析可以看出(图4)，糖类物质在种子吸水膨胀阶段(B阶段)含量显著增加，氨基酸类物质则随着种子萌发过程的推进，含量逐渐降低，当种子达到D阶段即发芽结束后，氨基酸含量又有所回升，而有机酸及其他化合物则表现为在萌芽初期存在一定含量，随着萌发过程的推进，在种子胚芽伸长阶段(B阶段)其含量下降到最低水平后，有机酸和化合物含量继续攀升，在种子发芽基本完成后(C阶段)达到最高水平，随后逐渐降低。

2.3 KEGG通路分析

将筛选出的差异代谢物导入Metabo Analyst，得到代谢通路气泡图(图5)，其中气泡大小代表影响因子大小，气泡越大影响因子越大；颜色深浅代表P值大小，颜色越深P值越小，小分子代谢物积累程度越高[16]。同时利用拓扑Fenix进行通路分析，经分析映射出13条可能的代谢通路(表2)，代谢途径6条，生物合成途径5条，转化途径1条，降解途径1条。其中5条与有机酸有关，3条与氨基酸有关，可见不同萌发阶段主要对玉米籽粒中的氨基酸及有机酸类物质产生影响。经分析后筛选得出1条具有显著意义的途径(p<0.05或Impact >0.2)，为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，这条途径与氨基酸代谢有关，有两个差异代谢物富集到此途径上，分别为甘氨酸和丝氨酸。

表2 代谢通路富集结果

3 结论与讨论

种子萌发作为植物生长发育中最初阶段也是关键阶段[4]，萌发过程中种子中的贮藏物质随着代谢过程不断发生变化，直接影响种子中代谢物的积累，来吉祥等[17]研究表明，萌发可以提高谷豆类作物中营养物质的利用率，同时降低种子中的有害物质。玉米作为重要的杂粮粮食作物，其中的糖类及蛋白质类等营养物质的利用率较低，董艳等[18]研究表明，经发芽处理后的杂粮营养结构及保健功能可以得到一定程度的提高。

本研究利用气相色谱质谱联用技术(GC-MS)结合生物统计学方法对玉米种子华农138萌发过程中的四个阶段(8 h、36 h、80 h、108 h)进行代谢组学分析，对比萌芽初期阶段，其余发芽过程中的代谢产物含量均有增加，其中糖类变化最为明显，糖类作为淀粉物质的主要分解产物，在种子萌发初期发挥重要作用，糖类物质参与的糖酵解等代谢途径是种子萌发的主要能量来源[19]，在本研究中，对筛选出的15种差异代谢物进行分析，糖类物质在种子萌发初期萌动阶段含量显著增加，这与薛梅真等[10]对玉米萌发初期可溶性糖代谢机制研究结果一致。脂肪作为种子中的重要储能物质，其在种子萌发过程中提供的能量来源为淀粉或蛋白质类物质的2倍[20]，在种子萌发的过程中，脂肪通过水解等方式转化为甘油、脂肪酸等有机酸类物质参与代谢途径，为发芽提供能量。本研究中，在不同萌发阶段筛选出的差异代谢物存在6种有机酸，共参与了5条差异代谢途径，随着种子萌发吸胀进程的推进，细胞不断吸水破裂导致脂肪类有机酸外渗[20]，种子中有机酸含量不断降低，在萌动阶段达到最低水平，随后含量增加在发芽阶段达到最高值后逐渐下降，这与油料作物种子萌发过程中脂肪酸的变化趋势相同[21]，由于在种子的萌发过程中，萌动阶段通过糖酵解途径提供的能量不足以满足发芽阶段种子的生命活动需要，脂肪在萌发阶段水解通过乙醛酸循环、丙酮酸代谢等途径不断转化为小分子有机酸类物质，为种子继续提供能量。蛋白质作为玉米种子中的重要物质基础，其降解产物氨基酸是人类生命活动所必需的，有研究表示，种子的萌发过程可以有效改善作物中的氨基酸含量，同时提高人体所需的必需氨基酸指数[22]，在本研究中，差异代谢物中存在4种差异氨基酸参与了3条代谢途径，其中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢途径具有显著意义，同时差异氨基酸在玉米种子的吸胀阶段含量水平较高，而随着发芽进程的推进含量不断降低，在发芽阶段含量达到最低值，随后在成苗阶段攀升至最高水平，说明种子在萌发过程中，氨基酸类物质在种子吸水激活后不断为种子的呼吸氧化过程提供碳源及氮源[23]。

本研究通过对玉米种子萌发过程不同阶段(吸胀阶段、萌动阶段、发芽阶段、成苗阶段) 代谢物含量进行差异分析，发现在玉米种子发芽过程中，差异代谢物主要集中在有机酸、氨基酸及糖类物质，存在一条氨基酸代谢途径具有显著意义，在玉米种子发芽初期的吸胀、萌动阶段糖类物质水平最高，提供主要能量来源，而当到达发芽阶段种子中的脂肪降解提供能量，有机酸含量达到最显著水平，而在种子萌发的全过程中，氨基酸含量逐渐降低，当发芽完成后成苗阶段，氨基酸水平达到最高。本研究利用代谢组学手段研究了不同萌发阶段种子中代谢物含量差异，完成了不同萌发阶段的差异代谢物筛选及代谢通路鉴别，这可以为提高玉米中营养利用率及发展高效优质玉米品种提供一定的理论参考。