黄芩苷通过TGF-β1/ERK1/2信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖

刘洁 史红健 熊雨 范婧莹 苏芮 王贤文 吴新正 江志超 何迎春

〔摘要〕 目的 探討黄芩苷（baicalin）对鼻咽癌CNE2细胞增殖及TGF-β1/ERK1/2信号通路的作用。方法 采用CCK8法检测不同浓度黄芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、顺铂（4 μg·mL-1）在24、36、48 h对CNE2细胞增殖的作用;细胞成像多功能检测系统（CytationTM 5）实时监测黄芩苷对CNE2增殖数量的变化;Western blot检测黄芩苷对CNE2细胞增殖相关蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2信号通路关键蛋白TGF-β1、p-ERK1/2的影响。结果 CCK8结果显示，黄芩苷可抑制CNE2增殖（P<0.05或P<0.01），且随着浓度升高，抑制作用增强;CytationTM 5监测结果显示，黄芩苷可抑制CNE2细胞数量增多（P<0.05或P<0.01）;Western blot结果表明，黄芩苷下调了增殖相关蛋白PCNA（P<0.05）、Survivin（P<0.05）及TGF-β1/ERK1/2信号通路关键蛋白TGF-β1（P<0.05）、p-ERK1/2（P<0.05）的表达水平。加入TGF-β1（TGF-β1/ERK1/2信号通路激活剂）后，黄芩苷对TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用降低（P<0.05），同时降低了黄芩苷对CNE2细胞增殖的抑制作用。结论 黄芩苷能够抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖，并通过抑制TGF-β1/ERK1/2信号通路进一步降低下游蛋白PCNA、Survivin的表达发挥作用。

〔关键词〕 鼻咽癌;黄芩苷;细胞增殖;TGF-β1/ERK1/2信号通路

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.004

Baicalin Inhibits Nasopharyngeal Carcinoma Cell Proliferation Via TGF-β1/ERK1/2

Signaling Pathway

LIU Jie1， SHI Hongjian1，2，3， XIONG Yu1， FAN Jingying1，2，3， SU Rui1， WANG Xianwen2，3，4， WU Xinzheng2，3，

JIANG Zhichao2，3，5， HE Yingchun1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 5. Brain Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of baicalin on proliferation and TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Methods CCK8 method was used to detect the effect of different concentrations （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 μmol·L-1） of baicalin and cisplatin （4 μg·mL-1） on proliferation of CNE2 cells at 24， 36 and 48 hours. Cell imaging multifunctional detection system （CytationTM 5） was used to monitor the changes of baicalin on proliferation of CNE2 cells. Western blot was used to detect the effect of baicalin on PCNA， Survivin and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1， p-ERK1/2 in CNE2 cells. Results CCK8 results showed that baicalin could inhibit proliferation of CNE2 （P<0.05 or P<0.01）， and the inhibition increased with the increasing of concentration. The monitoring results of CytationTM 5 showed that baicalin could inhibit the quantity increasing of CNE2 cells （P<0.05 or P<0.01）. Western blot results showed that baicalin down regulated the protein expression levels of PCNA （P<0.05）， Survivin （P<0.05） and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1 （P<0.05） and p-ERK1/2 （P<0.05）. After adding transforming growth factor-β1 （TGF-β1， TGF-β1/ERK1/2 signal pathway activator）， the inhibitory effect of baicalin on TGF-β1， p-ERK1/2， PCNA and Survivin was decreased （P<0.05）， and the inhibitory effect of baicalin on CNE2 cell proliferation was also decreased. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and further reduce the expression of downstream proteins PCNA and Survivin by inhibiting TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway.

〔Keywords〕 nasopharyngeal carcinoma; baicalin; cell proliferation; TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway

鼻咽癌发病地域特点明显，主要在我国南部高发，由于其发病部位特殊、放化疗敏感度较高，目前临床依然采用放疗为主的联合治疗[1]。近年来，随着中医药的深入研究和挖掘，中医药及其活性成分抗肿瘤研究亦取得了较大突破，许多抗肿瘤单体的药效及作用机制有了实验验证，为阐明中医药抗肿瘤机制提供了充分的理论依据[2]。

黄芩苷（baicalin）是中药黄芩、半枝莲等的主要活性成分之一，研究发现，黄芩苷具有广泛的抗癌活性[3-4]，在鼻咽癌的研究中，WANG C等[5]研究发现黄芩苷可抑制自噬、逆转鼻咽癌细胞放疗抵抗性，李静等[6]证实，黄芩苷能够抑制鼻咽癌荷瘤鼠肿瘤发生发展，但黄芩苷抑制鼻咽癌增殖的作用机制尚不明确。TGF-β1在大部分肿瘤中表达上调，是肿瘤细胞免疫逃逸的主要调控因子之一[7]，且刘婷等[8]的研究证实，TGF-β1能够调控鼻咽癌细胞株的增殖和迁移等行为。因此，探讨黄芩苷对鼻咽癌细胞的作用和对TGF-β1信号通路的影响及两者的相关性，可进一步明确黄芩苷抗鼻咽癌的效应及机制，为开发抗鼻咽癌的中药单体丰富理论基础，本实验拟研究黄芩苷对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响，并检测其对增殖相关蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2的调控作用，以期为后续研究提供实验参考。

1 实验材料

1.1  细胞株

人鼻咽癌CNE2细胞（批号：BNCC341794）购自北京北纳创联生物技术研究院，由本实验室传代培养。

1.2  主要药物

黄芩苷（批号：P20A9F59353，纯度≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司;顺铂（Cisplatin，Cis）（批号：MKCM2435）购于美国Sigma公司;TGF-β1（批号：1218209）购于美国Pepro Tech公司;LY3200882（批号：C24H29N5O3）购于美国Target Mol公司。

1.3  主要试剂

RPMI-1640培养基（批号：AE24464298）购自Hyclone公司;胎牛血清（批号：42A0378K）购自Gibco公司;胰蛋白酶消化液（批号：20201113）购自北京索莱宝公司;PCNA 抗体（批号：AH08154078）购自Bioss公司;Survivin 抗体（批号：15）、p-ERK1/2抗体（批号：24）、β-actin 抗体（批号：18）均购自CST公司;TGF-β1 抗体（批号：GR3252552-1）购自Abcam公司。

1.4  主要仪器

双人单面净化工作台（型号：SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）;CO2培养箱（型号：HERAcell 150i，赛默飞世尔公司）;全自动酶标分析仪（型号：ELX800，BioTek公司）;细胞成像多功能检测系统（型号：CytationTM 5，BioTek公司）;双色红外荧光成像系统（型号：Odyssey-CLX，Gene有限公司）。

2 实验方法

2.1  CCK8法检测细胞增殖

常规消化细胞后，调整细胞悬液至5 000个/100 μL，于96孔板中加入100 μL细胞悬液，待细胞贴壁后弃上清液，加入含不同浓度黄芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培养液。分别于24、36、48 h后弃上清，加入100 μL CCK8溶液，孵育1.5 h后于450 nm波长测吸光度，并计算细胞相对增殖指数。

细胞相对增殖指数=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）

2.2  CytationTM 5监测细胞增殖

常规消化细胞后，调整细胞悬液至5 000个/100 μL，于96孔板中加入100 μL細胞悬液，待细胞贴壁后弃上清液，加入含不同浓度黄芩苷（5、10、20、40 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培养液。将96孔板置于CytationTM 5细胞成像多功能检测系统仪器内，设置6 h拍照1次，总时长48 h。待监测结束后，计算细胞数量，并计算细胞的相对增殖指数。

2.3  Western blot法检测蛋白表达水平

根据CytationTM 5监测结果，发现黄芩苷20、 40 μmol·L-1的浓度抑制增殖效果较好，因此，设置对照组、黄芩苷20 μmol·L-1组、黄芩苷40 μmol·L-1组、Cis 4 μg·mL-1组干预细胞后进行蛋白测定。后续机制部分研究以TGF-β1作为TGF-β1/ERK1/2信号通路激活剂，LY3200882作为信号通路抑制剂，具体分组如下：对照组、TGF-β1 10 ng·mL-1组、TGF-β1+黄芩苷组、黄芩苷40 μmol·L-1组、LY3200882 10 μmol·L-1组。

药物处理CNE2细胞36 h后，提取总蛋白，按BCA试剂盒方法定量后，按照60 μg上样量配置样品体系。配备10% SDS-PAGE分离胶，待分离胶凝固后加入5%浓缩胶，将样品加入相应的泳道，先按40 V恒压电泳，待样品浓缩好后，逐步增加至90 V或120 V。电泳结束后按照转膜夹黑色面→海绵→4层滤纸→胶→PVDF膜→4层滤纸→海绵→转膜夹红色面的顺序放置好后，在转膜槽倒入转膜液，按照200 mA、2.5 h的条件在冰上湿转。转膜结束后将PVDF膜放入5%的脱脂奶粉室温下封闭1 h，然后加入稀释好的一抗溶液，放入4 ℃冰箱孵育过夜。第2天先用TBST洗膜3遍，每次10 min，然后加入相应的荧光二抗室温避光孵育1.5 h。结束后洗膜3次，每次10 min，最后用双色红外荧光成像系统进行扫膜，并用Image Studio软件分析荧光强度。

2.4  统计学分析

采用SPSS 26.0进行分析，计量资料数据用“x±s”表示，服从正态分布且各组间方差齐时，采用单因素方差分析，LSD检验，方差不齐时，用Games-Howell（A）檢验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1  不同浓度黄芩苷抑制鼻咽癌细胞增殖

与对照组比较，24 h各浓度黄芩苷组，36 h和48 h的黄芩苷20、40、80 μmol·L-1组和Cis 4 μg·mL-1组CNE2细胞增殖指数降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与黄芩苷2.5 μmol·L-1组比较，不同时间点黄芩苷（20、40、80 μmol·L-1）组细胞增殖指数降低，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。采用CytationTM 5进行实时动态监测进一步验证黄芩苷对CNE2细胞增殖的抑制作用，细胞在培养48 h后，黄芩苷各浓度组与对照组比较，CNE2细胞增殖明显被抑制。见表1和图1。

3.2  黄芩苷抑制鼻咽癌细胞PCNA、Survivin蛋白表达水平

与对照组相比，黄芩苷40 μmol·L-1组PCNA和Survivin表达水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）;黄芩苷 20 μmol·L-1组PCNA和Survivin表达水平下降不明显（P>0.05）。黄芩苷 20 μmol·L-1组和黄芩苷40 μmol·L-1组相比，PCNA 和Survivin表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

3.3  黄芩苷抑制鼻咽癌细胞TGF-β1/ERK1/2信号通路

与对照组比较，黄芩苷 40 μmol·L-1组TGF-β1和p-ERK1/2的表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;但黄芩苷20 μmol·L-1组表达水平降低不明显（P>0.05）。与黄芩苷20 μmol·L-1组相比，黄芩苷40 μmol·L-1组TGF-β1和p-ERK1/2表达水平降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

3.4  黄芩苷通过TGF-β1/ERK信号通路抑制CNE2细胞增殖

与对照组相比，TGF-β1 10 ng·mL-1组TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA和Survivin的表达水平上升，但差异无统计学意义（P>0.05）;TGF-β1+黄芩苷组TGF-β1和p-ERK1/2表达水平均下调，但差异无统计学意义（P>0.05）;PCNA和Survivin的表达水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）;黄芩苷40 μmol·L-1组和LY3200882组p-ERK、PCNA、Survivin的表达水平下降，差异均有统计意义（P<0.05或P<0.01），黄芩苷组TGF-β1下调（P<0.05），但LY3200882组TGF-β1下调不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。与TGF-β1+黄芩苷组比较，黄芩苷40 μmol·L-1组TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA表达降低不明显（P>0.05），Survivin表达水平降低且差异具有统计学意义（P<0.01）（图4A、4B）。CytationTM 5监测细胞增殖结果显示，TGF-β1 10 ng·mL-1组细胞增殖指数明显上升，但与对照组比较差异无统计意义（P>0.05）。与TGF-β1+黄芩苷组相比，黄芩苷40 μmol·L-1组细胞增殖指数降低，但差异无统计学意义（图4C）。

4 讨论

鼻咽癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，治疗方案以放化疗为主，辅以手术治疗，但作用有限且黏膜糜烂、口干、神经损伤等不良反应明显[9]。而我国传统医药在鼻咽癌临床应用中疗效显著，能够改善鼻咽癌患者的症状，提高生活质量[10]。研究[11-12]表明，黄芩苷具有抗肿瘤作用，能够抑制肺腺癌A549细胞上皮间质化、抑制T细胞淋巴瘤增殖并诱导凋亡。

本研究首先通过CCK8检测了黄芩苷对鼻咽癌细胞增殖活性的影响，结果表明，不同浓度黄芩苷均可抑制鼻咽癌细胞增殖，且随着浓度升高，抑制作用更加明显。同样，CytationTM 5实时监测细胞增殖结果显示，黄芩苷可抑制CNE2细胞数量的增长，进一步表明黄芩苷可抑制鼻咽癌细胞增殖。PCNA与肿瘤的发生发展密切相关，课题组前期研究表明，PCNA在鼻咽癌细胞中呈高表达状态[13-14]。Survivin是肿瘤标志物之一，与鼻咽癌的分化增殖有关[15-16]。益气解毒方和三萜类化合物齐墩果酸、茯苓酸、熊果酸及黄芪甲苷均可降低PCNA和Survivin表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖[17-18]，表明药物通过抑制PCNA和Survivin的活性可以发挥抗鼻咽癌作用。本实验结果显示，黄芩苷能够下调鼻咽癌细胞中PCNA和Survivin的蛋白表达水平，提示黄芩苷抑制鼻咽癌细胞增殖可能是通过抑制PCNA和Survivin实现的。

TGF-β主要参与细胞增殖、分化及免疫调节等过程，既可以在正常细胞中参与细胞正常生理过程，当肿瘤发生时，又可以作为促肿瘤因子推动肿瘤细胞的恶化[19]。TGF-β1是TGF-β超家族中研究得最多的，也是与肿瘤发生发展最密切的，因此，本研究通过Western blot检测了黄芩苷对TGF-β1蛋白水平的影响，结果显示，黄芩苷组的表达水平与对照组比较明显下调（P<0.05），说明黄芩苷能够抑制TGF-β1活性。TGF-β1/ERK1/2途径属于非Smad依赖性TGF-β信号通路中的一条，TGF-β1可以激活MAPK/ERK信号通路，其中以ERK1/2为主，引起一系列级联反应并产生相应的生物学行为[20]。在本课题组的相关研究中，发现ERK的活化可促进PCNA、Survivin的蛋白表达水平[11，21]。而黄芩苷能够降低p-ERK1/2蛋白表达水平，说明黄芩苷对鼻咽癌细胞TGF-β1/ERK1/2信号通路具有抑制作用。在TGF-β1/ERK信号通路被激活后，黄芩苷对TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用减弱了，同时黄芩苷抑制CNE2细胞增殖的能力被降低，而LY3200882组蛋白表达水平和增殖率均降低，与黄芩苷组作用趋势基本一致，说明黄芩苷可能作为TGF-β1的抑制药物发挥抗鼻咽癌细胞增殖作用，提示黄芩苷抑制CNE2细胞增殖的作用可能是通过调控TGF-β1/ERK1/2信号通路实现的。

综上所述，本研究初步证实了黄芩苷能够抑制鼻咽癌细胞增殖，其部分作用机制是通过抑制TGF-β1/ERK1/2信号通路，进而降低下游蛋白PCNA、Survivin的表達。

参考文献

[1] 邱前辉，高俊潇.鼻咽癌外科治疗的历史与现状及展望[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2020，26（5）：473-477.

[2] 王  姣，于  佳，胡万福，等.临床常用抗肿瘤中药的作用机制及抗肿瘤方剂分析[J].癌症进展，2020，18（9）：884-886，900.

[3] 孔邦彦，魏立彬，郭青龙.黄芩苷的抗肿瘤作用研究进展[J].药学学报，2021，56（6）：1537-1543.

[4] 刘梦珂，纪濛濛，程  林，等.黄芩苷抗肿瘤作用机制的研究进展[J].上海交通大学学报（医学版），2021，41（2）：246-250.

[5] WANG C， YANG Y L， SUN L N， et al. Baicalin reverses radioresistance in nasopharyngeal carcinoma by downregulating autophagy[J]. Cancer Cell International， 2020， 20（1）： 1-8.

[6] 李  静，高  雪，李玉凤，等.黄芩苷对鼻咽癌荷瘤鼠抑瘤作用的实验研究[J].中医临床研究，2017，9（13）：42-43.

[7] 陈兰玉，胡凯文.基于TGF-β信号通路探讨中医药改善肿瘤免疫微环境的研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2020，26（11）：1735-1738.

[8] 刘  婷.N-糖基化抑制通过调控TGFβ/smad通路对鼻咽癌细胞株恶性生物学行为的影响及其机制研究[D].广州：南方医科大学，2017.

[9] 沈  怡，强万敏.鼻咽癌病人同步放化疗期间症状群的调查研究[J].护理研究，2017，31（31）：3962-3966.

[10] 郭良芬，邱宝珊，黄  姿，等.中西医结合治疗对鼻咽癌患者生存质量的影响[J].新中医，2015，47（7）：112-114.

[11] 王  林，吴翠芸，汪贤竹，等.黄芩苷对肺癌A549细胞自噬及上皮间质转化的影响[J].中国细胞生物学学报，2020，42（11）：1960-1968.

[12] 肖  丹，钟  华，徐  岚，等.黄芩苷通过诱导ROS发生抑制人T细胞淋巴瘤的增殖并促进凋亡[J].肿瘤，2020，40（8）：541-548.

[13] LIU J， HE L， HU J， et al. Isoimperatorin induces apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells via the MAPK/ERK1/2 signaling pathway[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine， 2020， 2020： 2138186.

[14] 周芳亮，胡  晶，蔺  婷，等.PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3诱导鼻咽癌细胞凋亡中的调控作用[J].中国药理学通报，2021，37（1）：43-52.

[15] 明帮春，张书芳.鼻咽癌组织中survivin蛋白和HIF-1α表达水平及临床意义[J].解放军医药杂志，2017，29（6）：62-64，67.

[16] 徐茂林，陈晓华，孙  波.缺氧诱导因子-1α、生长素基因沉默对CNE-2鼻咽癌细胞放疗及凋亡敏感性的影响[J].中国免疫学杂志，2019，35（18）：2249-2252，2257.

[17] 刘  洁，胡  晶，戴  娜，等.益气解毒方主要三萜类化合物抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖效应的比较[J].湖南中医药大学学报，2019，

39（11）：1315-1320.

[18] 胡  晶，刘  洁，徐冰雁，等.益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞增殖的影响[J].湖南中医药大学学报，2019，39（8）：943-947.

[19] 胡  晶，刘  洁，徐冰雁，等.MAPK/ERK信号通路在益气解毒方水提物诱导鼻咽癌细胞凋亡中的作用[J].中国药理学通报，2019，

35（11）：1613-1621.

[20] 陶  涛，汪国文，李其才，等.人参皂苷Rg3通过TGF-β1/ERK信号通路调控原位荷瘤人肺癌裸鼠的淋巴管生成的机制[J].中国比较医学杂志，2019，29（11）：34-40.

[21] ZHOU F L， HU J， DAI N， et al. Berberine and ginsenoside Rg3 act synergistically via the MAPK/ERK pathway in nasophary?

ngeal carcinoma cells[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 66：103802.