基于龙牙百合胚拯救技术的植物组织培养综合实验教学设计

却志群， 沈春修， 李润根， 肖秋生

(宜春学院 生命科学与资源环境学院， 江西 宜春 336000)

植物组织培养是以植物细胞全能性为理论基础，在无菌和人工控制的环境条件下利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术[1]。《植物组织培养》是园艺专业的核心课程，该门课程涉及植物学、植物生理学、育种学等多个知识领域并且应用性强、实践性丰富[2]。为锻炼学生动手操作能力，使理论知识和实际操作技能有机结合，提高学生创新思维和综合素质，结合宜春学院生命科学与资源环境学院植物组织实验课内容单一、综合性实验偏少的现状，特开设龙牙百合胚拯救技术植物组织培养综合实验。龙牙百合在宜春市万载县有500多年的种植历史，是当地主栽品种之一，但如今存在品种退化、病害发生严重等问题[3]，亟待培育优良的百合新品种。常规杂交由于百合亲和性的影响导致后代存活率差异很大，胚拯救技术是克服受精后障碍的主要方法[4-5]。笔者所在教学团队前期通过胚拯救技术解决了龙牙百合和兰州百合远缘杂交受精后障碍，成功获得杂种苗[6-7]，并将其设计成植物组织培养课程综合实验项目。现将基于龙牙百合胚拯救技术的植物组织培养综合实验教学设计介绍如下，以期为植物组织培养及相近课程实验教学提供参考。

1 实验教学目的

通过实验课程掌握胚拯救技术的具体操作方法，定期观察胚萌发情况，统计杂种胚萌发率，分析不同激素配比对胚萌发的影响，探讨胚拯救技术的适用领域，提出自己的看法，能自行设计实验解决生产上面临的实际问题。

2 教学实施

2.1 实施对象

在宜春学院生命科学与资源环境学院2017级园艺专业32名学生中，以小组的形式开展该综合实验项目，每组4人，共8组。本项目课时10学时，其中理论讲解2学时，培养基配制与灭菌4学时，胚拯救接种操作4学时。

2.2 教学安排

综合实验安排在《植物组织培养》课程授课学期，开课第10～11周时学生对该课程的理论、基本操作已熟悉。采用翻转课堂[8]的教学模式，教师在第8周通过超星学习通平台发送实验相关PPT、课件、视频材料及相关问题，要求学生根据具体情况选取材料、试剂，查阅相关文献，撰写实验方案，并确定小组负责人及实验工作分工。课堂讲授阶段学生以PPT形式汇报实验流程及操作要点，各小组互评，对实验方案不足之处进行修正，教师最后进行点评，确定实验方案。随后进入正式实施阶段，考虑到实验内容的连续性和百合生长的季节性，实验操作安排在第10～11周教学工作日进行。第10周完成培养基的制作，第11周完成百合杂交果的取样、消毒、无菌接种、培养工作。定期观察百合杂交果的萌发状态并统计数据，实验全部结束后提交完整的实验报告。

2.2.1 实验材料的准备

1) 百合。以种植于宜春学院园艺基地的龙牙百合作母本，兰州百合作父本，取授粉后生长45 d以上的杂交果作为实验材料(图1)。

图1 百合杂交果

2) 仪器设备与试剂。仪器设备有超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、摇床、微波炉、移液器、离心机、光照培养箱、纯水系统、磁力搅拌器等。试剂有MS培养基干粉、蔗糖、琼脂粉、6-BA、NAA、HCL、NaOH、酒精灯。

2.2.2 实验方法

1) 培养基的设计。根据笔者所在教学团队前期探索结果，本次综合实验以1/2 MS为基本培养基，共设计9个组合培养基配方[6-7](表1)。

表1 不同激素配比的培养基配方

2) 外植体的消毒和接种。百合杂交果在流水下冲洗1 h，放入灭菌的空三角瓶中，置于超净工作台上，倒入75%酒精浸泡30 s，然后倒出，加入无菌水漂洗3次，取出杂交果放入另一灭菌的空三角瓶中，加入0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，期间不断晃动，再用无菌水漂洗5次，清除残留在材料表面的化学试剂，最后取出杂交果放在干燥的无菌滤纸上，吸干表面水分。用手术刀沿着果皮缝划开，再用无菌镊子取出有胚种子，在靠近酒精灯外焰处打开培养基瓶盖，接种到培养基上。

3) 外植体的培养。胚萌发之前放在温度25℃的暗室培养，2周后胚开始萌发移入光室培养，设定温度25℃，光照强度2 000 lx，光照时间12 h/d。每组共9个处理(每个激素配比培养基配方对应一个处理)，每处理2瓶，每瓶接种2～3粒杂种胚，接种60 d后统计不同处理杂种胚萌发情况。

2.3 教学效果

本次综合性实验课程结束后，笔者与部分2017级学生进行了面对面交流，学生普遍对这类实验的开设持满意态度，主动提出要加入相关教师科研团队从事简单的研究工作；也有部分学生提出了自己的建议，即在培养基配方设计上是否可以按照多因素统计分析方法设计更多组配方，因为是首次尝试，考虑到实验材料比较紧缺，以免造成浪费，所以在下一年的实验开设过程中将对此进行优化。

本实验以宜春特色品种龙牙百合杂交果作为研究对象，利用植物组织培养中胚拯救技术克服大田杂交不亲和导致百合杂交果不能发育成熟的问题，成功获得杂种苗，为后期通过杂交培育优质百合种苗奠定了基础。

通过以上综合性实验的开展，学生完全掌握了植物组织培养中胚拯救技术的知识要点，体会到了课本知识转化为实践成果的乐趣，激发学生学习兴趣，促进了学生专业能力的培养。本综合性实验与实际生产结合紧密，注重培养学生对知识的应用能力，同时有利于激发学生的科研兴趣。通过学习百合杂种胚拯救技术综合实验，把以前实验教学中单一的项目全部串联起来，对每一个知识点进行总结归纳，容易形成系统的知识架构，有利于创新思维能力的培养。

3 小结

龙牙百合胚拯救技术综合性实验选题来自百合团队多年科研成果的部分内容，是科研学术成果转化为教学内容的具体体现，实现了科研和教学的有机统一。学生在参与过程中，改变了过去被动学习知识的状态，提高了创新创业和科研思维能力，也激发了其科研潜力[9]。总之，该实验教学整合了植物组织培养实验课中多个知识点，贴近实际，实验效果好，有利于培养学生实践能力与创新能力，能够体现科研成果转化为实验教学的优越性，在后续教学过程中将逐步调整优化，争取在更大学生群体和更多相近专业中进行推广。