渝产叶用银杏种苗质量的分级标准

徐进，谭均，杨美森，张应

(1.重庆市中药研究院，重庆市中药良种选育与评价工程技术中心，重庆 400065；2.秀山县中药材产业中心，重庆 秀山 409900)

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgobiloba)秋季叶尚绿时采收的干燥叶[1]，含有广泛的具药理活性化学成分，尤其是黄酮类和萜类化合物[2-3].银杏叶提取物具有扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子的作用[4]，是当今世界最热门的植物药产品之一[5].为了适应工业生产对银杏叶质量的要求，国内从1992年开始发展用于收获绿叶的叶用银杏种植基地[6]，针对与果用、林用银杏生产特性的差异，开展了叶用银杏良种选育、密度控制、营养调控等种植技术的研究[6-7].

种子种苗是中药材生产的物质基础[8]，优质种苗是提高药材产量、质量和用药安全性的根本保障[9].我国中药材主要栽培品种有300多种，目前中药材种子种苗地方标准只颁布130多项，涉及91个中药材品种，人参、甘草等5项国家标准，人参、三七两项国际标准[9-10]，中药材种子种苗质量分级标准研究及标准制订仍需加快进程.近年来，重庆地区开始大量发展叶用银杏种植基地，但种源混乱，种质混杂，种苗质量参差不齐，且无叶用银杏种苗质量分级标准可供借鉴[11-13]，严重制约叶用银杏规范化生产.本文收集重庆地区叶用银杏实生苗，结合生产实际开展种苗质量分级标准研究，旨在为叶用银杏种苗标准的制订提供科学依据，规范种植源头，保障叶用银杏种苗生产及流通，促进重庆地区叶用银杏的规范化发展.

1 仪器与材料

1.1 试验材料

2018年12月在重庆叶用银杏主产区云阳、秀山、彭水、万州等县/区共收集30个批次叶用银杏种苗，样品编号和具体产地见表1.所有种苗均为采自育苗基地树龄2 a的实生苗，每批样品随机选取100株，经重庆市中药研究院瞿显友研究员鉴定为植物银杏(Ginkgobiloba).

表1 30批叶用银杏种苗来源

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 Angilent 1260高效液相色谱仪及Chem Station工作站(美国安捷伦公司)；Alltech 2000 ES蒸发光散射检测器(美国奥泰公司)，QUINTIX125D-1CN十万分之一天平(德国赛多利斯公司)，Mill-Q advantage A10超纯水仪(法国默克密理博公司).

1.2.2 试剂 银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯、槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为190515 02、19090505、19092601、19101701、19101104、18101911和19080310)；纯度≥99%(HPLC).液相用甲醇、乙腈均为色谱纯；其余试剂均为分析纯.

2 方法

2.1 种苗质量指标的测定

测定每株种苗的株高、地径、主根长、一级侧根数、分枝数，统计每批次种苗分枝率.株高测定采用精度为1 mm直尺测量种苗地上部分长度；地径测定采用游标卡尺测量地上部分离地2 cm处非膨大处直径；主根长测定采用精度为1 mm直尺测量种苗主根长度；一级侧根数为主根上超过2 cm的侧根数量；分枝数为主干上长于2 cm的分枝数量；分枝率为同批次中具有分枝的种苗占种苗总数百分比.

2.2 种苗质量分级标准的制订

采用SPSS 19.0统计软件对叶用银杏种苗质量指标进行统计描述、相关性分析和聚类分析，根据分析结果和生产实际按照最低定级原则制订银杏种苗质量分级标准，即同一等级种苗的任一指标若达不到标准则降为下一级.

2.3 种苗质量分级标准验证试验

2018年12月底，选取同一来源1级、2级、3级和不合格叶用银杏种苗，采用随机区组设计，3次重复，共12个区组，每个小区100 株，按株行距0.5 m×0.6 m，定植于重庆市博责农业公司基地.

2019年8月底叶片尚绿时，选择连续多日晴天后采收，采收前统计各小区成活率，每小区随机选取10株测定生长指标和单株叶鲜重.成活率为每小区内成活植株占定植总株数的比率；新发主茎长测定采用精度为1 mm直尺测量本年度新生主茎长度；总分枝数为末端枝条超过2 cm的枝条总数；新发枝条数为当年从主干或枝条上萌发出超过2 cm枝条数量；叶片数为所有正常伸展叶片总数.将各小区银杏叶称重后，带回实验室50 ℃烘干至恒重，计算折干率，粉碎过60目筛后用于质量测定.

2.4 药材质量评价

银杏叶含量按《中国药典》(2020版一部)方法进行测定[1].

3 结果与分析

3.1 种苗质量的测定

对30批叶用银杏种苗株高、地径、主根长等6个质量指标的测定结果见表2，各质量指标的统计分析结果见表3.不同产地种苗的株高、地径、根长、一级侧根数、分枝数等指标差异均达到极显著水平(P<0.01)，均可作为叶用银杏种苗质量分级标准的依据.各质量指标变异幅度分别为株高13.00～135.00 cm、地径3.09～18.53 mm、主根长1.00～50.00 cm，一级侧根数1～50根，分枝数0～14枝，分枝率3%～78%.变异程度为分枝率>分枝数>一级侧根数>主根长>株高>地径.

表2 30批叶用银杏种苗质量测定

表3 叶用银杏种苗质量指标统计分析 (n=3 000)

3.2 种苗质量分级指标的确定

叶用银杏种苗质量指标的相关分析见表4.叶用银杏种苗株高与地径、平均分枝数、分枝率极显著正相关(P<0.01)；主根长与一级侧根数存在极显著正相关(P<0.01)；主根长与株高、分枝率显著正相关(P<0.05).说明叶用银杏种苗地上、地下部分的质量指标分别具有极显著相关性，地上和地下部分的生长又具有关联性.

30批银杏种苗质量指标的主成分分析结果见表5.主成分因子1、因子2特征值均大于1，累计贡献率达81.01%，具有较强的信息代表性，可以概括种苗质量.决定因子1大小的主要指标为株高、地径和分枝率性状分量，决定因子2大小的主要指标为根长、一级侧根数和平均分枝数性状分量.理论上株高等6个指标均可作为银杏苗的分级参考指标.

表4 叶用银杏种苗质量指标的相关分析

表5 各质量指标的特征向量及贡献率

根据叶用银杏种苗株高等6项质量指标进行K-均值聚类，结合生产实际拟分为3个等级，得到3个等级种苗质量标准的最终聚类中心值，见表6；分级指标的方差分析结果见表7.F值从大到小依次为分枝率>株高>地径>主根长>平均分枝数>一级侧根数，不同批次银杏种苗间株高、地径、分枝率差异显著.

表6 叶用银杏种苗质量指标K-均值聚类的最终类中心值

表7 叶用银杏种苗质量指标的方差分析

因此，6个质量指标均能反映种苗质量；株高、地径、分枝率对分级影响显著，应作为分级指标；一级侧根数、平均分枝率对分级影响不显著，不同等级最终聚类中心值差异不大，可作为约束性指标；因种苗移栽时须剪去过长主根，以促进侧根和一级侧根生长，生产上考察主根长意义不大，不建议作为分级指标.

3.3 种苗质量分级标准的制定

聚类分析各类间中心距离结果见表8.第2类和第3类间中心距离最大，其次为第1类和第2类，第1类和第3类中心距离最小.说明30个不同来源银杏种苗可划分为3个质量等级，第2类属于一级苗，第1类属于二级苗，第3类属于三级苗.

表8 各指标最终聚类各类间中心距离

以聚类中心值为参考，结合生产实际制定银杏种苗等级标准，见表9.根据分级标准，30批银杏种苗观测样本中一级种苗2批，二级种苗7批，三级种苗13批，不合格苗8批，分别占征集种苗批的6.67%、23.33%、43.3%和26.67%.

3.4 种苗质量分级标准验证

3.4.1 不同等级种苗生长情况 不同等级叶用银杏种苗定植次年存活率和生长情况见表10.由表10可知，不同等级银杏苗定植次年成活率、总分枝数、新发枝条数、叶片数、新发主茎长、单株鲜叶质量具有一定差异，且差异显著(P<0.05).其中一级苗总分枝数、叶片数、新发主茎长、单株叶片鲜重极显著高于其他等级.一、二级苗总分枝数、新发枝条数、叶片数极显著高于三级苗和不合格苗，三级苗和不合格苗各生长指标差异不显著.

3.4.2 不同等级种苗产量 不同等级叶用银杏种苗定植次年产量情况见表11.不同等级种苗定植次年的单株鲜叶质量和折算亩产量均存在显著差异，种苗等级越高产量越高.一级苗单株鲜叶质量和折算亩产量最高，分别达59.0 g和46.53 kg/667 m2，该级单株鲜叶质量显著高于其他等级种苗，二级、三级和不合格苗间无显著差异；二级苗折算亩产量与三级苗的无显著差异，显著高于不合格苗的.不同等级种苗种植次年产叶的折干率无显著差异.

表9 叶用银杏种苗质量分级标准

表10 不同等级叶用银杏苗次年生长情况

3.4.3 不同等级种苗药材质量 对不同等级叶用银杏种苗定植次年生产的银杏叶药材进行质量测定，结果见表12.不同等级种苗生产药材的内酯成分中银杏内酯B、银杏内酯C含量存在显著差异，一级、二级苗含萜类内酯含量显著高于三级和不合格苗.不同等级种苗生产药材的黄酮成分中异鼠李素、山奈酚含量存在显著差异，不合格苗总黄酮醇苷最高，显著高于三级苗，一级苗总黄酮醇苷最低，与二级苗无显著差异，显著低于三级苗.不同等级苗叶片中含萜类内酯、总黄酮醇苷含量均达到药典标准.

表11 不同等级叶用银杏苗次年产量情况

表12 不同等级叶用银杏种苗药材活性成分的含量

4 讨论与结论

本研究通过对重庆叶用银杏育苗区30份叶用银杏种苗的质量考察和分析，结合生产实际，选定株高、地径、分枝率、一级侧根数及平均分枝数作为重庆叶用银杏种苗质量分级指标，将供试样品分为3个等级标准：一级苗：株高≥70 cm，地径≥9.5 mm，分枝率≥70%；二级苗：株高60～70 cm，地径8.5～9.5 mm，分枝率35%～70%；三级苗：株高≥50 cm，地径≥7.5 mm，分枝率≥12%；且各级苗一级侧根≥15条，平均分枝数≥2枝.

本分级与主要造林树种苗木质量分级标准略有差异，因根长度采挖时受人为因素影响较大，不能客观定量，故未将根长纳入分级指标[12].种苗定植次年高等级苗成活率、成活后长势、生物量积累均高于低等级苗，与蒋冬生等研究结果一致[11]，说明优质种苗更利于提高定植后成活率及产量[14].总黄酮醇苷和总含萜内酯均为次生代谢产物，其形成机制复杂，受光照、水分、温度等环境因素影响[15-16]，造成不同等级总黄酮醇苷及含萜内酯存在显著性差异.鉴于不同等级种苗黄酮和萜内脂含量均超过药典标准，说明此等级划分具有可行性，生产上建议一、二级苗作为叶用银杏种苗使用.

根据中药材生产规范化需要，为推进中药材种子种苗生产的标准化进程，近年来，中药材种子种苗质量分级标准研究进展显著.受植物生长特性影响，中药材种子种苗分级标准研究报道中种子质量分级研究多于种苗质量分级研究，种子种苗质量分级研究则集中在一年生或多年生草本类药材，如素花党参[17]、黄连[18]、鱼腥草[19]、甘草[20]等，木本类药材种苗质量分级报道较少，仅见忍冬[21]、连翘[22]、刺五加[23]、枳壳[24]等药材.然而，多年生药材生产周期长，以花、果实、种子等入药的多年生中药材，投产周期均相对较长，种苗的品种及质量选择尤为重要，优质的种子种苗能够提高存活率，有效提前投产年限，因此中药材种子种苗质量分级标准研究不容懈怠.