新疆部分规模奶牛场牛病毒性腹泻病的流行情况调查与防控措施

王晨豫，宋 洁，曹梦园，陈明杰，魏 勇，齐亚银＊

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000

2 新疆天润乳业股份有限公司，新疆乌鲁木齐 830000

0 引言

牛病毒性腹泻病（Bovine Viral Diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）感染牛引起的以出现发热、腹泻、消化道黏膜糜烂、产奶量下降、流产和死胎等为主要临床症状的一类急性、接触性传染病，被还是世界动物卫生组织列为三类动物疫病[1]。同时，BVDV也是牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC，BRDC）重要的病原，能引起奶牛持续性感染、免疫抑制，长期乃至终生带毒，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失[2]。

新疆奶牛养殖业从小户散养及小规模养殖场逐步向集约化、规模化的模式转型。目前，新疆一些大规模牧业公司已经制定了统一的管理模式、生产经营模式，并根据不同地区的环境，因地制宜地制定了饲养管理、营养调配、环境控制等具体方案。通过制定严格的消毒程序和免疫程序，这些牧场的疫病防控与前几年相比已经发生了翻天覆地的变化。尤其是规模奶牛场对BVD非常重视，对其采取“免疫-检疫-淘汰”等一系列的防控措施[3]。

本试验对南疆阿克苏市和北疆乌鲁木齐市、奎屯市、昌吉市、沙湾县5 个地区16 个规模奶牛场采集全群牛群血清、犊牛耳组织，并采用IDEXX BVDV抗原检测及RT-PCR复检结合测序等方法，监测BVDV在不同奶牛场的感染、流行情况，为实施阻断传播途径、淘汰阳性牛、建立疫病净化场提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BVDVELISA抗原检测试剂盒/血清购自IDEXX公司；PrimeScript™ RT Master Mix购自TaKaRa公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TIANamp Virus RNA Kit购自天根公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ购自诺唯赞公司；RNA专用氯仿、RNA专用75%乙醇、异丙醇等购自上海生工公司。

1.2 样品来源

2020年11月至2021年7月，累计对新疆5 个地区共计16 个规模奶牛场的新生犊牛7日龄内采集2～3 mm耳组织于2 mL离心管中，置于-20 ℃保存。其他牛群全群进行尾静脉采血，置于采血器中析出血清，编号分装至1.5 mL离心管中，-20 ℃保存备用。

1.3 血清及耳组织抗原检测

ELISA检测：从-20 ℃冰箱取出的先前采集的各牛场血清及犊牛耳组织，恢复至室温后，犊牛耳组织往离心管中加入200 μL耳组织浸泡缓冲液过夜浸泡。分别按照Bovine viral diarrhoea virus antigen test Kit/Serum Plus（BVDV Ag/Serum）产品说明书对血清中和耳组织BVDV抗原分别进行检测。

BVDV血清抗原检测试剂盒结果判定：检测计算样品的校正OD值。被检样品的S-N值≤0.300，判为BVDV抗原阴性；被检样品的S-N值＞0.300，判为BVDV抗原阳性。

BVDV耳组织抗原检测试剂盒结果判定：检测计算样品的校正OD值。被检样品的S-N值≤0.200，判为BVDV抗原阴性；被检样品的S-N值＞0.300，判为BVDV抗原阳性。被检样品的0.300＞S-N值≥0.200，判为BVDV抗原可疑。

1.4 BVDV 病原RT-PCR 检测

1.4.1 样品来源

病原检测样本来源于血清学抗原检测阳性血清，对阳性牛采集粪便、鼻腔分泌物，提取RNA，反转录成cDNA，进行RT-PCR复检。取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，经凝胶成像扫描仪观察目的片段大小。通过胶回收目的条带，送检测序。

1.4.2 引物设计

根据张信军等[4]采用的方法，设计通用检测引物（表1），由上海生工合成。

表1 引物序列、位置及大小

1.4.3 RT-PCR扩增

按照天根公司的TIANamp Virus RNA Kit说明书方法提取血清中的RNA，根据TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒说明书方法将提取的RNA反转录获得cDNA，置于-20 ℃保存备用。

1.4.4 PCR反应体系及扩增条件

PCR反应体系及扩增条件见表2。

表2 PCR 反应体系及扩增条件

反应结束后，取8 μLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳和EB染色后，经凝胶成像扫描仪观察目的片段大小。

1.5 序列测定

1.5.1 目的条带的回收

取无菌的1.5 mL EP管称量后标记，将RT-PCR试验阳性条带用刀片全部切下，装入EP管中称重。按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行，产物保存于-20℃冰箱中。

1.5.2 T载体连接及转化

将胶回收得到的产物与pMD19-T载体按照pMD19-T载体试剂盒说明书进行连接，各组分加至无菌的EP管中，混匀后放在连接仪中16 ℃过夜。将连接产物导入E·coliDH5α。加入预热无抗生素的LB液体培养基，充分混匀，放入37℃恒温摇床中，复苏菌体。涂于含有氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上，放在37℃的恒温箱内培养12 h。

1.5.3 菌液PCR验证

在平板上挑取单个菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基，进行PCR验证，结果为阳性的菌液，高速离心后，弃液体，留下沉淀，送检测序。

2 结果

2.1 试验奶牛场BVDV 抗原检测结果

牛群血清检测结果为：沙湾某奶牛场的血清抗原阳性率为1.63%，乌鲁木齐某奶牛场为0.35%，其余奶牛场均为阴性（表3）。犊牛耳组织抗原检测结果为：乌鲁木齐某奶牛场犊牛耳组织的抗原阳性率为1.17%，其余奶牛场的耳组织检测均为阴性（表4）。

表3 南北疆部分规模奶牛场的血清BVDV 抗原检测结果

表4 南北疆部分规模奶牛场的犊牛耳组织BVDV 抗原检测结果

2.2 试验奶牛场RT-PCR 复检结果

对新疆部分地区奶牛场的BVDV抗原阳性牛进行RT-PCR复检，结果如图1。共计检测46 头牛血清及其对应的阳性牛鼻腔棉拭子和阳性牛鼻粪便拭子，复检均为阳性。

图1 病原核酸检测结果

2.3 测序结果

将8 份阳性样品的测序结果在NCBI中与BVDV参考株进行序列对比，结果得出阳性样品属于BVDV-la型。

3 讨论

BVD 对养牛业的危害巨大，且到目前为止没有特效药物用于治疗，一直是规模奶牛场的困扰。李娜等[5]于2009年对新疆石河子地区进行BVDV的分子流行病学调查，BVDV抗原阳性率为39.06%，2019年朱广艺[6]对南疆某规模化养殖场奶牛进行BVDV调查，抗原阳性率为0.38%。2019—2020年魏勇等[3]对新疆不同区域部分规模化及传统奶牛场进行BVDV抗原调查，阳性率为0.79%。本试验于2020年11月至2021年7月对新疆16 个规模奶牛场BVDV抗原阳性率为0.16%。结果显示，防控BVDV需要采取有效的防控净化措施，控制与净化的首要步骤都是及时发现持续感染牛。然后，根据本地本场的牛群密度和感染率来制定防控措施[7]。

首先，要加强奶牛场的消毒防控，制定消毒程序。使用复方醛类、氢氧化钠、生石灰对奶牛场圈舍、道路、圈舍周边的绿化带等区域进行定期消毒。

其次，要加强免疫。犊牛刚出生后免疫一次哞乐优（BVDV-IBR二连灭活疫苗），间隔1 个月后加强免疫1 次。全群在每年4～10月中普免2 次。使用经巴氏消毒过的牛初乳来喂养新生犊牛。

第三，定期对奶牛场全群做BVDV抗原检测。对刚出生1 周龄以内的犊牛进行耳组织BVDV抗原检测，若为阳性则暂时隔离饲养，采集鼻拭子、粪便或血清送至实验室进行RTPCR复检，如结果仍为阳性，需将阳性犊牛淘汰。另外，血清阳性率较高的地区要做好持续的抗原检测，做好持续免疫措施，来淘汰和减少阳性牛，并做好综合性生物安全保护体系建设，维持BVDV的净化状态，避免新发BVD牛的出现。