三维荧光二阶校正法用于水样中培氟沙星和氧氟沙星的同时测定

谢丽霞 李志能

汤建新1, 2 谭益民1, 2

郑思乡3 廖晓珊3

1. 湖南工业大学

生命科学与化学学院

湖南 株洲 412007

2. 百合种质资源创新与深加工

湖南省工程研究中心

湖南 株洲 412007

3. 株洲市农业科学研究所

湖南 株洲 412007

1 研究背景

氟喹诺酮类（fluoroquinolones）抗生素如诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星等，是一类人工合成的广谱抗菌药，通过抑制细菌的DNA解旋酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ来影响细菌的DNA复制[1-2]。氟喹诺酮类抗生素广泛用于治疗家禽家畜疾病（由细菌、支原体感染引起的消化、呼吸等系统疾病）[3]，但是，滥用抗生素现象较严重。抗生素的不合理使用不仅危害动物健康，而且未被家禽家畜吸收的抗生素会随排泄物进入环境水体，给人类的健康和生态环境造成威胁[4-7]。因此，迫切需要建立一种简单有效且可以实现环境水样中多种氟喹诺酮类药物同时检测的方法，以满足环境水体中痕量抗生素的监测需求。

目前，氟喹诺酮类药物的检测方法以液相色谱与各种检测器联用为主，如紫外检测器[8-9]、荧光检测器[10-11]、质谱检测器[12-14]。用液相色谱与检测器联用法时，需要对样品进行繁杂的预处理（如液液萃取、膜分离等），对液相色谱分离条件进行优化，这会消耗大量的有机溶剂，且繁杂的预处理势必会损失目标分析物，使其定量分析不准确。此外，毛细管电泳法[15]、酶联免疫法[16]检测氟喹诺酮类抗生素的研究也有报道，但是毛细管电泳法灵敏度（sensitivity，SEN）低、检测限（limit of detection，LOD）高，酶联免疫法存在有机物间的交叉反应，因而两者在氟喹诺酮类抗生素定量分析中的应用受到一定限制。

直接用荧光检测技术定量分析复杂环境体系中氟喹诺酮类抗生素时，氟喹诺酮类抗生素之间的光谱重叠[17]以及自然水体中存在的内源荧光物质会对测定结果产生干扰，因而需要其他手段或方法进行辅助。化学计量学二阶校正方法具有二阶优势，以数学分离有效地代替复杂的物理分离，可以在有未知干扰存在的情况下获取目标物的定性定量信息[18-21]。因此，本研究拟以培氟沙星和氧氟沙星为目标物，采用三维荧光结合二阶校正法进行同时定量测定。

2 方法原理

2.1 三线性成分模型

经三维荧光测量，单个样本可以得到一个大小为I×J的激发发射荧光矩阵，I、J分别为激发、发射波长通道数。将K个样本测量得到的荧光矩阵在第三维上进行组合，可以得到一个三维荧光响应数据阵（I×J×K）。由于物质的荧光强度与浓度符合朗伯-比尔定律，因此，理想情况下满足三线性成分模型，模型中元素xijk为

式中：N为测量体系中所有具有响应信号的组分数，包含感兴趣目标分析物、未知干扰成分及噪声等；

ain、bjn、ckn分别为具有物理意义的相对激发光谱矩阵A（I×N）、相对发射光谱矩阵B（J×N）和相对浓度矩阵C（K×N）中的元素；

eijk为三维荧光残差数据阵中的元素。

式（2）～（4）中：Xi..、X.j.和X..k分别为三维荧光数据阵在I、J和K方向的切片矩阵；

Ei..、E.j.和E..k分别为三维荧光残差数据阵在I、J和K方向的切片矩阵；

ai、bj和ck分别为相对谱矩阵A、B和C的行矢量；

diag(.)为构造对角矩阵函数。

若矩阵A、B和C的秩r满足条件rA+rB+ rC≥2N+2，那么三线性成分模型的分解将是唯一的。

2.2 交替三线性分解算法

交替三线性分解算法[22]（alternating trilinear decomposition，ATLD）由吴海龙提出，用于解析三维数据阵，对三线性成分模型的3个切片矩阵进行迭代最小二乘求解，结果如下：

通过使用ATLD算法对获得的三维荧光数据阵进行三线性成分分解，可以获得与物质信息相关的谱图矩阵，即相对激发矩阵、相对发射矩阵和相对浓度矩阵。再将校正集中感兴趣组分对应的相对浓度与真实浓度进行一元线性回归，得到单变量校正曲线，可以进一步预测感兴趣组分在预测样中的浓度。

2.3 品质因子

品质因子是用于评估三维荧光校正方法性能的参数。而预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）[23]可用于评价预测结果的准确度，其计算式为

式中：P为样本总数目；

yp和分别为某个组分的真实浓度和预测浓度。

灵敏度[24]可用于评价方法的敏感程度，其计算式为

式中：kn为单位浓度待分析物的纯信号，即单变量校正曲线中的斜率；

Aex和Bex分别为所有已校正组分在激发通道和发射通道上的相对光谱矩阵；

Aun和Bun分别为所有未校正组分在激发通道和发射通道上的相对光谱矩阵；

*表示Hadamard积；

nn为（n，n）处元素，表示第n个待分析物。

采用检测限和定量限[25]评价方法的检测和定量能力，其计算式如下：

式中s(0)为采用该方法进行定量分析时，空白样本中感兴趣目标物预测浓度的标准误差，其计算式为

其中，h0为所用方法空白样的杠杆；

和分别为校正浓度方差、仪器信号方差；

SEN为该方法的灵敏度。

3 实验部分

3.1 试剂与仪器

试剂：培氟沙星（质量分数为99%）、氧氟沙星（质量分数为99%）、氢氧化钠、醋酸钠和醋酸，均购买自Aladdin；环境水样来源于长沙湘江岳麓区段。所有溶液均用超纯水配制。

仪器：荧光光谱仪，F-7000型，日立；超纯水Milli-Q A10系统，默克集团；pH酸度计，PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司。

3.2 样品配制与检测

精确称取一定量的培氟沙星和氧氟沙星，分别经浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶解后，用醋酸钠/醋酸缓冲液（pH值为4）在10 mL棕色容量瓶中定容，使其质量浓度分别为2, 4 μg/mL；再置于4 ℃下避光稳定储存30 d。使用时，先用醋酸钠/醋酸缓冲液（pH值为4）稀释一定倍数，再用于样品制备。

校正集由7个已知浓度的标准样本构成。校正集中感兴趣的目标物培氟沙星和氧氟沙星的浓度水平依据U7（72）均匀实验设计[26]确定。校正样本配制步骤如下：根据均匀实验设计的浓度，分别准确移取一定体积的培氟沙星和氧氟沙星稀释液于10 mL棕色容量瓶中，用醋酸钠/醋酸缓冲液（pH值为4）定容至10 mL，摇匀备用。

预测集由5个加标的湘江水样本（以下简称加标样本）和3个未加标的湘江水样本（以下简称未加标样本）构成。加标样本配制步骤如下：分别准确移取一定体积的培氟沙星和氧氟沙星稀释液于10 mL棕色容量瓶中，再准确移取1 mL湘江水于该棕色容量瓶中，最后用醋酸钠/醋酸缓冲液（pH值为4）定容至10 mL，摇匀备用。除了未加待分析物，3个未加标样本与加标样本的制备方法一样。同时，配制了3个方法空白样本以及1个培氟沙星参考样本（ref01）和1个氧氟沙星参考样本（ref02）。所有样本的详细浓度设计见表1。

表1 培氟沙星和氧氟沙星的浓度设计Table 1 The concentration designs of pefloxacin and ofloxacin in samples

所有样本的荧光测量使用F-7000荧光光谱仪，以氙灯作为光源，室温下在10 mm荧光比色皿中进行。测量荧光的激发波长和发射波长范围分别为230～400 nm, 360～580 nm（间隔均为2 nm）。激发和发射狭缝宽度设置为5 nm，扫描速度固定为12 000 nm/min，检测电压为500 V。所用数据在Matlab软件上进行处理，相关程序用Matlab语言编写。

4 实验结果与讨论

4.1 待分析物和体系的光谱属性

图1为培氟沙星参考样本、氧氟沙星参考样本和湘江水样的三维激发发射矩阵（excitation-emission matrix，EEM）荧光图以及加标样本spik01的二维EEM投影图。

图1 培氟沙星、氧氟沙星和湘江水样的三维EEM荧光图和spik01的EEM二维投影图Fig. 1 The EEM fluorescence spectra for pefloxacin, ofloxacin and the sample from Xiangjiang River, and the two-dimension contour for the spik01 sample

彩图

由图1可知，在所选择的光谱区域内，培氟沙星在278 nm处有最大激发峰，在449 nm处有最大发射峰，且在315 nm处存在一个较弱的激发荧光峰；而氧氟沙星在295 nm处有最大激发峰，在504 nm处有最大发射峰，且在330 nm处存在一个较弱的激发荧光峰；对于湘江水样，体系中包含具有自发荧光的有机质；培氟沙星、氧氟沙星和背景体系中的未知干扰物之间存在严重的荧光光谱重叠现象，待分析物的荧光光谱不具有完全选择性。

在激发波长为230～400 nm、发射波长为360～580 nm范围内，存在严重的瑞利散射和拉曼散射。这两类散射对应的数据不具有三线性结构，导致测量的三维EEM荧光数据偏离三线性成分模型，致使ATLD算法不能正确地解析出各个方向上的相对轮廓矩阵。为此，本研究采用插值法[27]处理受瑞利散射和拉曼散射影响的数据区域，将处理后的三维数据阵用于三线性成分模型。

4.2 组分数选择

将7个校正样本、5个加标样本、3个未加标样本和3个方法的空白样本激发发射荧光数据在样品维上依次排列，可以得到一个激发-发射-样本三维荧光数据阵，其大小为18×86×111。三线性分解之前，先采用核一致诊断（core consistency diagnostic）方法[28]对三维荧光数据阵中的组分数进行估计，防止欠拟合或过拟合现象。在核一致诊断方法中，以核一致数值为考察对象，其定义为Tucker3核数阵与理论超对角单位数阵一致的方差百分比。当核一致数值由一个较大数值骤然减小为一个较小数值时，表明合适的组分数已被估计出。

图2所示为激发-发射-样本三维荧光数据阵的核一致诊断结果。

图2 三维荧光数据阵的核一致诊断结果Fig. 2 The result of three-dimension fluorescence spectra matrix of core-consistency diagnosis

由图2可知，此体系中，当选取组分数为1, 2, 3时，核一致数值都对应于100%；组分数大于3时，核一致数值开始减小；当组分数为5时，核一致数值减小为0。考虑到ATLD算法解析数据时对组分数不敏感，多余的组分数可以拟合数据中的噪声，因此本研究采用组分数为4进行数据处理，4个组分分别为培氟沙星、氧氟沙星、水样中的未知干扰和噪声。

4.3 三线性分解

本研究选取组分数为4，采用ATLD算法对激发-发射-样本三维数据阵进行解析。图3为用ATLD算法分辨体系中具有荧光响应信号物质的相对激发光谱、相对发射光谱和相对浓度图，以及两个感兴趣组分在各个光谱方向上的真实谱图。

图3 ATLD算法解析结果Fig. 3 The results obtained from the ATLD algorithm

由图3可知，培氟沙星、氧氟沙星和湘江水样中存在的荧光干扰物质的光谱相互重叠；培氟沙星的相对激发光谱和相对发射光谱与实际测量的归一化标准谱图之间的相关系数分别为0.997 4和0.995 9，氧氟沙星的相对激发光谱和相对发射光谱与实际测量的归一化标准谱图之间的相关系数分别为0.996 9和0.994 7。上述结果表明，分解所得培氟沙星和氧氟沙星的荧光激发和发射谱图与实际谱图具有高度一致性，这说明采用ATLD算法解析本研究体系中的三维荧光数据阵，可以准确地分辨出培氟沙星和氧氟沙星在各个方向上的谱图信息。

4.4 定量结果

用上述解析得到的校正样本中培氟沙星和氧氟沙星的相对浓度信息分别与其真实质量浓度进行单变量线性回归，建立相应的线性回归方程。之后，将预测样本中培氟沙星和氧氟沙星的相对浓度分别代入方程中，即得预测样本中目标物的定量分析结果。图4所示为待分析物培氟沙星和氧氟沙星的一元校正曲线。

图4 基于ATLD算法的三维荧光二阶校正法的线性回归结果Fig. 4 The univariate regression in three-dimension fluorescence spectra coupled with second-order calibration method based on the ATLD algorithm

由图4可得，两种分析物的回归方程分别为y= 40.06x+242.97和y= 34.27x–257.08，二者的相关系数分别为0.999 2和0.997 5。该结果说明，培氟沙星和氧氟沙星在其校正浓度范围内都具有良好的线性关系，进一步说明了基于ATLD算法的校正模型是准确的。

表2中列出了基于ATLD算法的三维荧光二阶校正法，对加标样本中培氟沙星和氧氟沙星的定量分析结果。为了进一步评价本文所提方法的性能和可行性，本研究计算了其灵敏度（SEN）、选择性（SEL）、检测限（LOD）、定量限（LOQ）等品质因子（见表2）。

表2 三维荧光二阶校正方法对加标预测集的定量分析结果和品质因子Table 2 The quantitative results obtained from threedimension fluorescence spectra coupled with second-order calibration method in spiked samples and the figures of merit

由表2可知：

1）加标样本中培氟沙星和氧氟沙星的预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）分别为8.29, 7.13 ng/mL，平均加标回收率（均值±标准偏差）分别为（101.1±5.3）%,（99.7±4.7）%。可见定量分析结果符合要求，表明基于ATLD算法的三维荧光二阶校正法可以实现环境水样中培氟沙星和氧氟沙星的准确定量分析。

2）对于待检测分析物培氟沙星和氧氟沙星，本方法的灵敏度分别为8.05, 8.25 ng/mL，检测限分别为2.14, 4.34 ng/mL，定量限分别为6.49, 13.16 ng/mL。虽然在纯溶液中，单位浓度下培氟沙星荧光强度大于氧氟沙星的，但是在复杂体系中未知干扰物的荧光光谱与培氟沙星光谱重叠，导致用本方法检测培氟沙星的灵敏度比氧氟沙星略低。

5 结论

本研究提出了基于ATLD算法的三维荧光二阶校正法，用于环境水样中两种氟喹诺酮类抗生素培氟沙星和氧氟沙星的同时快速定量分析。实验结果表明：本方法能在光谱重叠以及存在未知干扰物的情况下，准确获取待分析物的激发光谱、发射光谱和相对浓度信息，能对环境水样中培氟沙星和氧氟沙星进行定量分析，实现环境质量实时监控。三维荧光二阶校正法是一种准确、灵敏、经济、高效和绿色的定量分析方法。