应用real-time PCR定量检测果园葡萄霜霉病菌潜伏侵染

杜娟 李金 张涛 张游 姚珮 顾沛雯

摘要： 为明确葡萄霜霉病菌潜伏侵染阶段的菌量与病害发生的关系，本研究对贺兰山东麓宁夏立兰酒庄酿酒葡萄园3个试验样地进行采样调查，分析3个样地检测的分子病情指数（MDI）与果园田间调查的病情指数（DI）的相关性。结果表明，宁夏立兰酒庄酿酒葡萄园3个样地的MDI和DI呈极显著相关，3个样地的MDI均与采样后15 d的DI拟合性最高;当MDI值为0.003 5～0.184 1时，采样后12 d葡萄霜霉病在果园零星发生。MDI大于0.003 5时，可作为当地酿酒葡萄霜霉病防治预警指标。

关键词： 葡萄霜霉菌;real-time PCR;分子病情指数;田间病情指数

中图分类号： S436.631.1   文献标识码： A   文章编号： 1000-4440（2021）04-0861-06

Quantitative detection of latent infection of grape downy mildew in field by real-time PCR

DU Juan， LI Jin， ZHANG Tao， ZHANG You， YAO Pei， GU Pei-wen

（College of Agronomy， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract：  In order to clarify the relationship between the latent infection amount of grape downy mildew in the orchard and the occurrence of the disease， three sample plots in Ningxia Lilan vineyard were investigated， and the correlation between molecular-detected disease index（MDI） and orchard disease index （DI） was analyzed. The results showed that there was a very significant correlation between MDI and DI in three sample plots of Ningxia Lilan vineyard， and the MDI of the three sample plots had the highest fitting with the DI on the 15th day after sampling. When the MDI value ranged from 0.003 5 to 0.184 1， grape downy mildew occurred sporadically in the orchard on the 12th day after sampling. When MDI is greater than 0.003 5， it can be used as an early warning index for prevention and control of local wine grape downy mildew.

Key words： Plasmopara viticola;real-time PCR;molecular-detected disease index;disease index

由葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）侵染引起的葡萄霜霉病是世界范圍内葡萄生产中最严重的病害之一[1-2]，也是中国葡萄生产中最重要的病害和监控研究的对象[3-5]。该病害主要依靠气流传播，具有发生范围广、流行速度快、危害程度重的特点[6]。潜伏期菌量的定量检测是病害进行早期监测预警的关键[7-8]。在潜伏期，病原菌在葡萄叶片内不断蔓延，一旦进入发病期，在适宜条件下葡萄霜霉病便会大面积流行，给葡萄生产造成严重损失[9]。因此，对处于潜伏侵染状态的葡萄霜霉病菌进行及时、准确的定量分析，不仅可实现葡萄霜霉病的早期诊断和对该病流行趋势进行准确预测，还可及早制定正确防控策略并采取防控措施，减少产量损失。

近年来，real-time PCR技术已被广泛应用于植物体内病原菌潜伏侵染定量研究[10-11]。Yan等[12]首次提出分子病情指数（MDI）的概念，即病原菌DNA浓度与寄主植物DNA浓度的比值，并将它用于衡量病害潜伏侵染的菌量。Zheng等[13]利用人工接种的叶片建立了MDI和田间调查的病情指数（DI）的线性关系，从而对发病情况进行估测。潘阳等[14]建立了小麦条锈病菌双重real-time PCR检测体系，可在一个反应体系中同时确定病原菌和寄主植物2种目标DNA的浓度并获得MDI。Knüfer等[15]应用real-time PCR技术分析病害进展曲线下的面积来研究油菜黄萎病的潜伏期菌量。刘琦等[16]发现小麦条锈病潜伏期的MDI与DI之间存在极显著相关性，表明可以利用MDI对田间实际发病情况进行早期预测。Liu等[17]研究认为，及时、准确地量化病原菌潜伏侵染阶段的菌量，明确MDI与田间调查得到的DI的关系是病害预测和防治的关键。

目前国内外开展了一系列对葡萄霜霉病菌潜伏侵染阶段的定性或定量研究[18-21]，大多为室内研究，有关果园葡萄霜霉病菌早期潜伏侵染定量的研究尚未见报道。本研究在前期建立了葡萄霜霉病菌的real-time PCR定量检测体系的基础上，对处于潜伏侵染阶段的样品进行real-time PCR检测，获得侵染早期病原菌在寄主中的MDI值，病害发生后进行果园病情调查，计算DI值，通过葡萄霜霉病菌潜育期的MDI和DI的回归分析，确定MDI和DI的相关性，为有效测定葡萄霜霉病菌潜伏侵染阶段的菌量和准确预测该病害的流行趋势提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验在宁夏贺兰山东麓立兰酒庄酿酒葡萄园（38°16′N，105°57′E，海拔高度1 190 m）进行，7～9月为酿酒葡萄霜霉病发生期，此期间平均气温22.01 ℃，平均湿度56.16%。供试酿酒葡萄品种为赤霞珠（Cabernet Sauvignon），树龄7 a，株距×行距：3 m×5 m，树形为斜干水平形，滴管水肥一体化，正常农事管理。

1.2 取样与调查

设置3个试验样地，记作LF-1、LF-2和LF-3，每块试验样地面积10.5 hm2（300 m×350 m），分割成126个50 m×50 m的样区。在葡萄霜霉病未显示症状时（2019年7月9日）采集样品。每个样区标记5株葡萄树，每株随机采集3片叶，共计15片叶，混合后作为一个样品进行DNA提取，进行MDI的检测。

采样结束后，对126个样区的相应位置进行病情调查，每3 d调查1次，至果园开始零星发病（约第12 d），随后统计第12 d、15 d和18 d的发病情况，进行DI的计算。DI调查点与MDI采样点为同一株葡萄树。调查时，在每株葡萄树上部、中部、下部随机调查30张叶片，每个样区共计调查150张叶片，记录葡萄霜霉病普遍率与严重度，病害发生程度分级指标参照农业部农药检定所颁布的葡萄霜霉病发生程度分级标准[22]。

DI=普遍率×平均严重度×100

普遍率是指发病的普遍程度，即发病率。普遍率=（病叶数/调查总叶数）×100%

平均严重度是指發病位点的严重程度。

平均严重度=∑（发病病级×该级病叶数）调查总病叶数×100%

1.3 样品real-time PCR检测

1.3.1 葡萄叶片DNA的提取 按照E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit（美国Omega Bio-tek公司产品）说明书提取每个样区葡萄叶片总DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.2 Real-time PCR定量检测叶片DNA和样品中病原菌DNA 根据GenBank中葡萄EF1-α基因（登录号：XM002284888.3）设计引物F-g-6、R-g-6，扩增葡萄叶片DNA。采用李文学等[21]报道的引物F-cox-Pv、R-Pv扩增葡萄霜霉病菌DNA。采用qTOWER 2.2荧光定量PCR仪（德国Jena 公司产品）进行real-time PCR扩增，引物序列见表1。

Real-time PCR反应体系（20.0 μl）：2×Trans Start Tip Green SuperMix 10.0 μl（北京全式金生物技术有限公司产品），正反引物（10 μmol/L）各0.4 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O补足。葡萄叶片和葡萄霜霉病菌real-time PCR反应条件均为：94 ℃预变性30 s;94 ℃变性5 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。

标准曲线的建立：将已知质量浓度的葡萄叶片和葡萄霜霉病菌的DNA质量浓度和各自的Ct值，通过软件real-time PCR soft 2.2分别生成葡萄叶片DNA质量浓度和葡萄霜霉病菌DNA质量浓度与Ct值的标准曲线，其中葡萄霜霉病菌的线性方程为Y1=18.01-3.60x1（R2=0.992 97），x1为葡萄霜霉病菌DNA质量浓度的对数值（lgC），Y1为葡萄霜霉病菌的Ct值;葡萄叶片的线性分析方程为Y2=26.38-3.06x2（R2=0.995 98），其中x2为葡萄叶片DNA质量浓度的对数值（lgC），Y2为葡萄叶片的Ct值。同时得到葡萄霜霉菌DNA质量浓度定量检测的最小检测限为1.0×10-4ng/μl，而葡萄叶片DNA质量浓度定量检测最小检测限为1.0×10-2ng/μl。

1.3.3 MDI的计算 参照闫佳会等[23]的方法分别计算每个样区的MDI。

MDI=葡萄霜霉病菌DNA质量浓度/葡萄叶片DNA质量浓度

1.4 数据分析

对3个试验样地的MDI与DI通过Excel 2016和SPSS 22.0进行回归分析，确定其相关性。

2 结果与分析

2.1 LF-1试验样地的MDI和DI的回归分析

应用SPSS软件和Excel对立兰酿酒葡萄园LF-1试验样地的MDI与采样后12 d、15 d和18 d果园调查的DI进行回归分析。LF-1样地的MDI和DI回归分析结果见图1，MDI与采样后12 d DI的回归方程为Y=48.211 0x+0.053 8（R2=0.779 7，P<0.01）;MDI与采样后15 d DI的回归方程为Y=86.281 0x+0.035 4（R2=0.903 3，P<0.01）;MDI与采样后18 d DI的回归方程为Y=111.360 0x+0.143 5（R2=0.875 8，P<0.01），结果表明，潜伏侵染阶段的MDI与DI极显著相关。当检测的MDI值在0.003 5～0.053 4时，12 d后葡萄霜霉病在果园零星发生。

综合3次病情的回归结果分析，直线斜率为48.211～111.360，即随田间病情指数调查时间的延后，利用MDI预测DI的单位增长率为48.211～111.360，差异较大。直线截距为0.035 4～0.143 5，差异较小。MDI与采样后15 d DI的回归方程的R2最高，此时MDI的最大检测值为0.053 4，其相应的DI的最大值为3.560。

2.2 LF-2试验样地MDI和DI的回归分析

LF-2样地回归分析结果见图2，MDI与采样后12 d DI的回归方程为Y=50.126 0x+0.501 0（R2=0.819 9，P<0.01）;MDI与采样后15 d DI的回归方程为Y=84.243 0x+0.560 9（R2=0.913 7，P<0.01）;MDI与采样后18 d DI的回归方程为Y=100.660 0x+1.016 1（R2=0.883 4，P<0.01），结果表明，潜伏侵染阶段的MDI与DI极显著相关。当检测的MDI值为0.009 9～0.165 1时，采样后12 d葡萄霜霉病在果园零星发生。

综合3次病情的回归结果分析，直线斜率为50.126～100.660，即随调查田间病情指数时间的延后，利用MDI预测DI的单位增长率为50.126～100.660。直线截距为0.501 0～1.016 1，差异较小。MDI与采样后15 d的DI回归方程的R2最高，MDI的检测范围在0～0.165 1，其相应的DI范围在0～16.000。LF-2试验样地发病率较高，42个样区中有30个检测到MDI，且MDI值越大，发病越严重。

2.3 LF-3试验样地MDI和DI的回归分析

LF-3样地回归分析结果见图3，MDI与采样后12 d DI的回归方程为Y=44.041 0x+0.279 0（R2=0.862 6，P<0.01）;MDI与采样后15 d DI的回归方程为Y=80.089 0x+0.702 0（R2=0.896 1，P<0.01）;MDI与采样后18 d DI的回归方程为Y=98.247 0x+1.205 3（R2=0.828 1，P<0.01），结果表明，潜伏侵染阶段的MDI与DI极显著相关。当检测的MDI值为0.011 3～0.184 1时，采样后12 d葡萄霜霉病在果园零星发生。

综合LF-3试验样地3次病情的回归结果分析，直线斜率在44.041～98.247，即随调查田间病情指数时间的延后，利用MDI预测DI的单位增长率为44.041～98.247。直线截距为0.279 0～1.205 3，差異较小。MDI与采样后15 d试验样地DI的回归方程的R2最高，MDI的检测范围为0～0.184 1，其相应的DI范围在0～13.33。LF-3试验样地MDI与采样后15 d DI的拟合性均低于LF-1和LF-2。

3 讨论

明确潜伏侵染阶段的菌量对于植物病害的预测和防治至关重要[23]。预测植物病害初始病情的传统方法主要是田间调查或室内离体培养[9， 24]，传统方法预测与田间病害实际发生情况差异较大，预测结果极为不准确。使用real-time PCR方法获得的MDI在病害流行学研究中有广泛的应用前景，相比于传统方法更加精确合理，更适用于果园病害早期监测预警等流行病学的研究[22]，是一种可靠的研究果园中葡萄霜霉病菌潜伏侵染的方法。

本研究通过对宁夏立兰酒庄酿酒葡萄园3个试验样地的MDI和DI的分析发现，二者之间呈极显著相关，这与Zheng等[13]和闫佳会等[23]在小麦白粉病和小麦条锈病上的研究结果相一致。3个试验样地均能检测到葡萄霜霉病菌，且LF-1试验样地存在MDI最低检测值为零，说明应用此方法对果园样品进行检测时，需要保证有充足的样本量才能够代表一个试验样地的分析结果。同时发现3个试验样地中都存在MDI的检测值不为零，但其DI值为零的情况。这一结果说明应用real-time PCR可以有效检测到尚未显示症状的葡萄叶片中微量的潜伏侵染阶段的菌量。综合3个试验样地调查的数据，当MDI检测值为0.003 5～0.184 1时，12 d后葡萄霜霉病在果园零星发生。取MDI值大于0.003 5作为防治预警指标。考虑到能检测到MDI时，葡萄霜霉病菌已经侵染到寄主体内，建议在防治时采用内吸性杀菌剂进行防治。

闫佳会等[23]认为MDI与DI的回归分析成功的关键在于采样时间和调查时间的确定。本研究采样时间是依据宁夏贺兰山东麓地区采样年度的气候条件和往年果园最早出现病害的日期综合考量确定的。宁夏立兰酒庄地处贺兰山东麓酿酒葡萄产区，该地区气候干旱、少雨，葡萄霜霉病一般在7月中下旬开始发生，8月进入盛发期[6，25-26]，因此本研究在7月上旬果园病害发生前进行样品采集，果园初见病斑时期进行果园调查，保证了在一个潜育期内完成果园样品检测和病情调查，避免了葡萄霜霉病菌再侵染对试验结果造成的干扰。

在植物病害的研究中，应用real-time PCR对植物病原菌潜伏侵染的研究已有很多[27-29]，Duvivier等[30]建立了空气中小麦条锈菌孢子密度的real-time PCR检测体系，用于预测田间病情。在MDI的应用方面，初炳瑶等[31]应用检测到的MDI值，并结合病情调查进行分析，对3种小麦条锈菌杀菌剂的防治效果进行评价，证实了MDI在药剂筛选中应用的可行性。刘琦等[16]结合光谱数据将MDI值转化为建立模型所需的分类标签，验证3种模型对小麦条锈病潜伏期定性识别的准确率。这些研究结果进一步证明了采用MDI的分析方法在植物病害防治研究中的应用前景广泛。本研究通过real-time PCR建立的果园葡萄霜霉病菌潜伏侵染的MDI方法能够快速、准确地定位发病中心和潜伏侵染阶段菌量，进而在早期对葡萄霜霉病的发生做出预警，指导果园病害防治工作，有效减少农药使用量。此外，由于葡萄霜霉病的发生还受到气象条件的影响，如遇降雨时，即使具有相同MDI值，葡萄霜霉病潜伏期也会大大缩短，此时更应提前做好防治工作。本研究仅开展了赤霞珠品种葡萄霜霉病MDI的研究，后续将在其他酿酒葡萄品种上做进一步验证，以提高利用MDI进行病害防治预警的实用性。

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（责任编辑：陈海霞）

收稿日期：2021-01-26

基金项目：国家重点研发项目（2019YFD1002502）;宁夏回族自治区科技重大专项（2019BBF02013）

作者简介：杜 娟（1995-），女，河南漯河人，硕士研究生，主要从事生物防治与菌物资源利用研究。（E-mail）dujuan3548@163.com

通讯作者：顾沛雯，（E-mail）gupeiwen2019@nxu.edu.cn