伊维菌素纳米乳中伊维菌素含量HPLC检测方法的建立

苗 艳，朱庆贺，陈 曦，杨旭东，王 爽，王丽坤，陈 亮，兰世捷，冯万宇，李 丹，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔161005)

伊维菌素(Ivermectin，IVM)具有广谱、高效、安全等优点，是一种使用广泛的抗寄生虫药物，对动物体内外寄生虫，尤其是线虫和节肢动物，具有高效驱杀作用[1-2]。由于伊维菌素几乎不溶于水，明显制约了伊维菌素的应用范围，尤其在制备伊维菌素注射剂型时，溶解伊维菌素需要大量使用有机溶剂，不仅增加了生产成本，也增大了对动物的刺激性[3]。伊维菌素由于其高效驱杀皮肤寄生虫的作用，常被用于制备抗牛羊寄生虫的透皮药物，但普通的透皮剂型效果不佳。为克服伊维菌素注射及透皮剂型的缺点，本研究室制备了高含水量的伊维菌素纳米乳剂，为水包油型乳剂，不仅降低了企业生产成本以及对动物的刺激性，而且已有研究表明，纳米乳剂能显著增加药物的透皮效果[4]，这为兽医临床中伊维菌素的应用提供了可选择的新剂型。由于自制伊维菌素纳米乳剂的进一步研究需要，本研究建立了纳米乳剂中伊维菌素的高效液相色谱含量检测方法，从而为自制伊维菌素纳米乳剂的稳定性考察以及含量检测提供技术支持。

1 材料与仪器

1.1 材料 伊维菌素标准品，含量92.0%，中国食品药品检定研究院；伊维菌素，含量95.7%，河北美荷药业有限公司；伊维菌素纳米乳剂样品(自制)，规格为1%伊维菌素纳米乳剂；乙腈/甲醇均为色谱纯，赛默飞世尔科技公司。

1.2 仪器 高效液相色谱仪，LC-20AT，日本岛津公司；二级管阵列检测器，SPD-M20A，日本岛津公司； InertSustain C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，岛津技迩(上海)商贸有限公司；纯水仪，XYE2-20-H型，北京湘顺源科技有限公司；电子分析天平，MS104TS/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；实验室pH计，FE20型，梅特勒-托利多(上海)有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相： 甲醇：乙腈：水(40∶55∶5)；检测波长254 nm；流速：1 mL/min；注温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取经干燥至恒重的伊维菌素对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成92.0 μg/mL的对照品储备液。精密量取1 mL对照品储备液，置于10 mL容量瓶中，容量瓶中加入流动相稀释至刻度，摇匀，0.45 μM微孔滤膜过滤，制备为浓度为9.20 μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 按照配方比例制备伊维菌素纳米乳剂，精密取样品适量(相当于伊维菌素10 mg)，置100 mL 容量瓶中，加流动相充分溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μM微孔滤膜过滤，制备为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 按配方比例量取与供试品相当的空白纳米乳剂(不含伊维菌素，其他成分与伊维菌素纳米乳剂相同)适量，按照2.2.2项下供试品溶液的制备方法制备为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性和专属性试验 分别取伊维菌素对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按2.1项色谱条件测定，结果见图1。在该色谱条件下，伊维菌素H2B1b和H2B1a峰保留时间分别为7.1和8.1 min左右，阴性对照在此时间附近未出峰，因此,对伊维菌素HPLC的测定没有影响，专属性能满足检测要求。

图1 HPLC 色谱图

2.4 线性试验 精密量取对照品储备液0.5、1.0、3.0、8.0、10 mL分别置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配置成浓度分别为4.6、9.2、27.6、73.9、92.0 μg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件测定，以B1a和B1b峰面积总和(y)对伊维菌素的浓度(x，μg/mL)进行线性回归，方程为y=15285x+12584，r2=0.9996。结果表明伊维菌素在4.6～92.0 μg/mL范围内线性关系良好(图2)。

图2 伊维菌素标准曲线

2.5 回收率测定 取适量伊维菌素对照品并添加配方剂量的空白纳米乳剂基质，超声溶解后用流动相稀释为高(110.4 μg/mL)、中(92.0 μg/mL)、低(73.6 μg/mL)3 种理论浓度的对照品，每个浓度配制 3 份，按2.1项下色谱条件测定其含量，计算回收率，结果见表1。结果表明高、中、低浓度对照品的平均回收率为98.25%～98.76%。该方法回收率符合要求。

表1 伊维菌素的回收率(n=3)

回收率R% = 实测浓度/理论浓度 × 100%

2.6 精密度的测定 取批号20191030的伊维菌素纳米乳剂样品适量(约相当于伊维菌素10 mg)，精密称定，按高、中、低三个浓度水平分别添加伊维菌素原料试药，制备为向已知含量制剂中添加已知测定物的添加样品，每个浓度水平的添加样品分别制备3份供试品。按2.2.2项制成供试品溶液，进行含量测定，计算精密度，结果见表2。结果表明高、中、低浓度供试品回收率为97.25%～100.14%，精密度良好，RSD小于2%。

表2 精密度试验结果

2.7 检测限(LOD)和定量限(LOQ)测定 取伊维菌素储备液分别配制为0.046、0.092、0.184、0.368 μg/mL浓度的检测溶液，按2.1项下色谱条件后过微孔滤膜进样测定，测得基线噪音值，以10倍信噪比(S/N>10)所对应的伊维菌素浓度为最低定量限，确定本方法定量限为0.092 μg/mL。以3倍信号强度与噪声强度的比值(S/N>3)所对应的伊维菌素浓度为检出限，确定本方法检出限为0.046 μg/mL。

2.8 样品含量测定 精密量取3批次的伊维菌素纳米乳剂样品，每批次3份，按2.2.2项制备为供试品溶液，进行含量测定。结果表明，批号为20191001、20191115、20191131的3批样品中伊维菌素平均含量分别为标示量的98.37%、99.68%、100.04%，符合规定。

3 结 论

紫外吸收峰值检测结果表明，伊维菌素在244 nm附近有最大吸收。但对比检测色谱图发现，244 nm液相色谱图杂峰对伊维菌素的主峰稍有干扰，而254 nm色谱图则分离良好。此外，参考兽药典2015版要求，伊维菌素应在254 nm处进行检测，所以本研究建立的纳米乳中伊维菌素含量检测方法选择254 nm进行检测。通过色谱结果的比较分析，在254 nm波长下测定，能够获得最大的灵敏度和抗干扰能力。

本实验室前期研发了伊维菌素微乳剂型[4]，为了更好的改良剂型，继续研发了伊维菌素纳米乳剂。纳米乳与微乳是近年来研究的热点载药剂型，两种剂型都是由油相、水相、表面活性剂以及助表面活性剂按照一定比例制备而成的粒径在100～1000 nm范围内的外观澄清透明的剂型[5]，但与微乳不同的是，纳米乳的制备需要借助外来能量(如机械搅拌或组分的化学能)才能形成稳定的体系[6]。纳米乳剂最早在农药相关制品中被应用，由于其水溶性好、稳定性好，最大限度的发挥了除草剂、杀虫剂以及一些杀菌剂的杀灭能力[7]。在中药挥发油领域中纳米乳剂也被广泛应用[8]，研究表明，将挥发油类药物制备为纳米乳剂，可以改善配方的稳定性，增强药物与细胞或受体的相互作用，增强靶向性，提高生物利用度，改善药物对粘膜、皮肤的通透性，减少药物对组织的刺激性，并有效保护挥发油的挥发和降解。近年来，纳米乳剂也有在抗生素中作为载药体系应用的报道，尤其对于难溶于水的药物，如由乙酰甲喹、利福昔明、氟苯尼考等药物制备的纳米乳剂[9-11]，研究表明乙酰甲喹纳米乳剂制品安全性良好，纳米乳剂能显著增加乙酰甲喹的透皮效果，并且相对生物利用度能达到乙酰甲喹溶液制剂的694.45%[9]。另外由于纳米乳剂具有无限溶于水，在水中分散良好的优点，研究人员研制了水产用伊维菌素纳米乳剂，解决了水产用乳油剂杀虫剂的局限[12-13]。在局部用药中纳米乳剂也有较为广泛的应用[6]，佛司可林纳米乳剂被研制成为透皮制剂，透皮效果显著[14]。

综合纳米乳剂的剂型优势以及兽医临床使用的需要，本实验室研发了兽用伊维菌素纳米乳剂，为更好的对新剂型药物的稳定性考察及含量检测，建立了纳米乳剂中伊维菌素的HPLC含量检测方法。本方法分离度好，伊维菌素H2B1b和H2B1a峰保留时间分别为7.1和8.1 min左右，峰形好，基本无拖尾，杂质不干扰实验测定，而且采用外标法测定伊维菌素纳米乳剂的含量操作简单，结果准确，回收率高，重复性好，是伊维菌素纳米乳剂中伊维菌素含量检测的简便、快速、准确的方法。