大枣果酒发酵剂的筛选及发酵条件优化

韩希凤，姜子涛，2*，盖旭，王俊全，李书启，魏萌，陈柳

（1.天津天狮学院食品工程学院，天津 301700；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

大枣作为我国特有果品，除含有大量的糖类、氨基酸，还富含维生素，如 VC、VP、VB等，具有护肝养肾、生津补血等多种功能作用[1-4]；枣树因适应性强，种植面积大，产量高，遍布山东、河南、陕西、甘肃等省，覆盖面极广[5]。目前，大枣精深加工产品少，以干制品为主，如何丰富大枣精深加工品的数量和质量提升其附加值，成为大枣走向产业化的重要课题[6]。大枣果酒是发酵型果酒，是利用酵母菌繁殖代谢将大枣中的糖转化为酒精的过程，得到的枣香浓郁、口感清爽的产品[7]。大枣中丰富的营养物质，为大枣果酒的制作提供了物质基础，且发酵后的大枣果酒具有一定的营养、药用价值且风味独特，在市场上的需求量日益增多。

酿酒工业的“四个转变”中的一个方面就是从粮食酒向果类酒的转化说明果酒的研制已成为今后果品精深加工品的研究的重点。市场上的枣酒主要有两种，一种是枣汁与酒精的勾兑酒，一种是经发酵剂酿制的发酵枣酒[9]。经发酵后的大枣果酒营养丰富，口味独特而备受人们的关注。酿造大枣果酒的发酵剂主要采用葡萄酒酿造用的品种，对适宜大枣果酒酿造的专用酿酒酵母研究较少。在酿造过程中，酿酒酵母种类与果酒的口感和风味有着直接的关系，这也是果酒品质形成的关键因素，因此，选择适合大枣果酒发酵的酿酒酵母种类显得尤为重要[10]。

本文以大枣果浆为原料，选取6种酿酒酵母（BO2B、X16、F33、EC-118、帝伯士、FX10）进行大枣果酒的酿制，通过比较发酵结束时大枣果酒中的总酸、抗氧化性以及感官评分等指标，筛选适合大枣果酒酿制的酵母菌。在此基础上，对筛选出的适宜酵母菌的发酵条件进行优化，得到该酵母菌发酵大枣果酒的最佳工艺条件，以期为提高大枣果酒的加工提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大枣：市售，表皮无损伤，色泽明亮的干枣，果肉丰满、坚韧，皱纹浅细；FX10、BO2B、X16、EC-118、F33、帝伯士（均为葡萄酒专用酵母，食品级）：烟台帝伯士商贸有限公司；果胶酶[（EC3.2.1.15）>40 0000 AJDU/g，食品级]：烟台帝伯士自酿机有限公司；1，1-二苯-2-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，分析纯）：北京索莱宝有限公司；水杨酸（分析纯）：成都科龙化工试剂厂；没食子酸（分析纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（UV2550）：日本岛津公司；高温灭菌锅（MJ-78A）：施都凯仪器设备有限公司；阿贝折射仪（WYA-ZT型）：上海仪电物理光学仪器有限公司；生化培养箱（SHX-150）：浙江金坛市万华实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 大枣果酒工艺流程

大枣→挑选→清洗→沥干→剪碎→烘烤（200℃、1.5 h）→浸泡 12 h→料液比 1∶3（g/mL）加水打浆→果胶酶酶解（果胶酶用量3%、3 h）→成分调整→灭菌（沸水浴15 min）→冷却→酵母菌活化（2%蔗糖水、28℃、15 min）→接种→发酵→陈酿→澄清→过滤→灌装→杀菌→成品[11-13]

1.3.2 主要指标测定及感官评价

1.3.2.1 可溶性固形物（soluble solid content，SSC）

SSC的测定参照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定 折射仪法》[14]。

1.3.2.2 总酸

总酸采用酸碱滴定法测定[15]。

1.3.2.3 酒精度

酒精度采用酒精计法[16]测定。

1.3.2.4 DPPH·清除率

DPPH·清除率参照王杰等[17-18]的方法测定。

1.3.2.5 羟基自由基（·OH）清除率

羟基自由基清除率参照曹力等[19]的方法测定。

1.3.2.6 超氧阴离子自由基（O2-·）清除率

O2-·清除率参照李安等[20]的方法测定。

1.3.2.7 感官评分

大枣果酒感官评分标准如表1所示。

表1 大枣果酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of Chinese jujube wine

该标准由14名专业人员组成的感官评分小组成员参照NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》[21]。感官评价小组成员对果酒进行评价打分（满分为100），取平均值作为试验结果。

1.4 大枣果酒发酵剂的筛选

分别称取制备好的大枣果浆100 g，调整初始pH4.0，6 种发酵剂（FX10、BO2B、X16、EC-118、F33、帝伯士）均按照接种量0.5 g/L、24℃下连续发酵8 d，每天测酒精度、SSC；发酵第8天时，测定DPPH·、·OH、超氧阴离子自由基（O2-·）清除率、总酸及感官评分。

1.5 大枣果酒发酵条件的单因素试验设计

1.5.1 初始pH值

分别称取制备好的大枣果浆50 g，按0.5 g/L接种，调整 pH 值分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，24 ℃下发酵7 d后，测酒精度及感官评分。

1.5.2 发酵温度

分别称取制备好的大枣果浆50g，调整初始pH4.0，接种量 0.5 g/L，在 16、20、24、28、32 ℃下发酵 7 d 后，测酒精度及感官评分。

1.5.3 酵母接种量

分别取制备好的大枣果浆50 g，调整初始pH4.0，分别按 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L 接种，在 24 ℃下发酵7 d后，测酒精度及感官评分。

1.5.4 发酵时间

大枣果酒适宜的发酵时间由酵母菌的筛选试验中获得，因此在单因素试验中不再进行。

1.6 F33酵母菌发酵条件的正交试验设计

根据大枣果酒发酵条件的单因素试验的结果，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、酵母接种量（C）和初始pH值（D）进行正交试验，因素与水平如表2所示。

表2 因素水平Table 2 Design of factors and levels

2 结果与分析

2.1 大枣果酒发酵剂的筛选

2.1.1 不同发酵剂对大枣果酒酒精度的影响

不同发酵剂对大枣果酒酒精度的影响见图1。

图1 不同发酵剂对大枣果酒酒精度的影响Fig.1 Effects of different starters on alcohol content of Chinese jujube wine during fermentation

由图1可知，随发酵时间的延长，6种酵母菌酿制的大枣果酒，其酒精度均呈上升趋势，但发酵剂不同，上升速率随发酵时间有所不同。发酵前4 d，6种酵母菌发酵的大枣果酒中，EC-118发酵的果酒其酒精度增加最慢，F33菌种发酵的大枣果酒虽然前4 d酒精度增加不明显，4 d后，酒精度急剧上升，7 d后，酒精度上升平稳。且发酵第7天时，F33发酵大枣果酒的酒精度高于其它5种菌种处理的，高达8.6%vol。就发酵速度及酒精度来说，F33菌种是比较适合大枣果酒发酵的发酵剂。

2.1.2 不同发酵剂对大枣果酒可溶性固形物的影响

在发酵过程中，酵母菌利用生长代谢中分泌的酶将大枣果浆中的糖转化为酒精。不同发酵剂对大枣果酒可溶性固形物的影响见图2。

图2 不同发酵剂对大枣果酒可溶性固形物含量的影响Fig.2 Effects of different starters on SSC of Chinese jujube wine during fermentation

由图2可知，随着发酵时间延长，6种发酵剂处理的大枣果酒中，可溶性固形物含量均呈下降趋势，但F33处理的大枣果酒下降最明显，说明F33酵母菌对糖的利用率高，发酵能力强。发酵结束后，测得F33发酵的大枣果酒中可溶性固形物最低为8.0%，FX10发酵的9.0%，仅次于F33发酵。因此，F33酵母菌是大枣果酒发酵能力最强的发酵剂。

2.1.3 不同发酵剂对大枣果酒总酸的影响

不同发酵剂对大枣果酒总酸的影响见图3。

图3 不同发酵剂对大枣果酒总酸的影响Fig.3 Effects on the total acidity of Chinese jujube wine by different starters after fermentation

由图3可知，6种发酵剂发酵果酒的总酸与最初大枣果汁的总酸0.32%相比，均呈上升趋势，发酵8 d后，BO2B菌种发酵的大枣果酒总酸最低为1.47%，FX10发酵的最高为2.01%，F33发酵的为1.69%，居中，即6种发酵剂产酸能力有差异，其产酸能力由低到高的顺序为 BO2B＜X16＜F33＜EC-118＜帝伯士＜FX10。

2.1.4 不同发酵剂对大枣果酒抗氧化性的影响

不同发酵剂对大枣果酒抗氧化性的影响见图4。

图4 不同发酵剂对大枣果酒抗氧化性的影响Fig.4 Effects of different starters on the antioxidation of Chinese jujube wine after fermation

由图4可知，6种发酵剂发酵8 d后的大枣果酒对·OH、DPPH·、超氧阴离子自由基（O2-·）均有一定的清除作用，发酵8 d后，3种发酵剂的大枣果酒清除DPPH·能力均最强，清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力最弱，清除·OH能力居中。X16酵母发酵的大枣果酒对3种自由基的清除能力是最弱的，F33、EC-118、帝伯士3种酵母发酵的大枣果酒对3种自由基的清除能力相差不大，均比较高；其中F33、EC-118、帝伯士3种酵母发酵的大枣果酒DPPH·清除能力均在98%以上。由此可见，经6种酵母菌发酵的大枣果酒因含有多酚及类黄酮化合物，可以看作是一种相对较强的自由基清除剂。

2.1.5 不同发酵剂对大枣果酒感官品质的影响

不同发酵剂对大枣果酒感官品质的影响见表3。

表3 不同发酵剂对大枣果酒感官品质的影响Table 3 Sensory evaluation of Chinese jujube wine fermented by different fermentation starters

由表3可知，感官评分总分最高的是由F33酵母发酵的大枣果酒，为88.6分，果酒枣香浓郁，无苦味，酒体透亮，呈琥珀色，无悬浮物，酒味酸甜适口，品质佳。FX10酵母发酵的大枣果酒感官评价得分最低为62.9分，且酒体苦味较重，酒质粗糙，有异味，不太适合饮用。6种发酵剂发酵的大枣果酒中，EC-118、BO2B、FX10发酵的外观得分都在20分左右，所得果酒颜色偏暗；FX10发酵的果酒枣香味最淡，F33发酵的果酒枣香浓郁，得分最高为27.2分；就滋味来说，帝伯士和FX10发酵的果酒均因苦味较重，得分偏低，X16发酵的果酒滋味较好，苦味轻，无异味，F33发酵的得分最高为35.2分，酸甜可口，无苦味。

综上所述，酵母菌种类与大枣果酒的口感及风味有直接关系，均成为大枣果酒品质形成的关键因素。通过比较6种发酵剂的发酵能力，比较发酵结束时，果酒中的总酸、抗氧化性以及感官评分，表明接种F33酵母的果浆中糖转化率高，发酵能力较强，发酵后果酒中的各项指标均优于其它5种发酵剂发酵的大枣果酒，因此，选择F33酵母制作大枣果酒。

2.2 F33酵母发酵条件优化

2.2.1 初始pH值

初始pH值对大枣果酒品质的影响见图5。

图5 初始pH值对大枣果酒品质的影响Fig.5 Effect on the quality of Chinese jujube wine by initial pH

由图5可知，初始pH值在3.0～4.0范围内时，大枣果酒的酒精度随着pH值的增加而升高，说明F33酵母菌的生长繁殖在pH值过低时会受阻，导致F33因生长缓慢而不能占据优势，降低酒精的生成量，而且杂菌所分泌的酶不能使糖类转化成乙醇，而导致大枣果酒酒精度较低（初始pH值为3.0时，酒精度为6.8%vol），酸味较重，感官评分低[22]。随初始pH值的升高，F33酵母菌的生长速度逐渐加快，pH值为4.0时，果酒酒精度达最大值8.8%vol；pH值再上升，大枣果酒的酒精度开始下降。初始pH值为4.0时，发酵得到的大枣果酒感官评分最高为70.8分，后随初始pH值上升，F33酵母菌的生长繁殖受到抑制，大枣果酒口感清淡，酸味增加，感官品质下降。由此，选取适宜的初始pH值为4.0。

2.2.2 酵母接种量

F33酵母接种量对大枣果酒品质的影响见图6。

图6 F33酵母接种量对大枣果酒品质的影响Fig.6 Effect of F33 yeast inoculation amount on the quality of Chinese jujube wine

由图6可知，F33酵母接种量在0.1 g/L～0.5 g/L范围内，大枣果酒酒精度逐渐上升，说明接种量越高，越有利于糖转化为酒精产物[23]；但高于0.5 g/L后，酒精度开始下降，这可能是接种量过高，酵母菌间竞争加剧，造成营养物质缺乏，而抑制了其生长繁殖[24]。当酵母接种量为0.5 g/L时，大枣果酒感官评分最高为80.2分，酒香味浓郁，品质最好，后随酵母接种量的增加，果酒感官品质下降，枣香、酒味变弱，有异味。由此，选取适宜的酵母接种量为0.5 g/L。

2.2.3 发酵温度

发酵温度对大枣果酒品质的影响见图7。

图7 发酵温度对大枣果酒品质的影响Fig.7 Effect on the quality of Chinese jujube wine by temperature

发酵温度过低时，发酵周期会因酵母菌生长缓慢而延长，且易染菌，致使产酒率降低，甚至发酵失败；发酵温度升高时，酵母菌生长繁殖随之加快，当酵母菌浓度逐步升高，产酒率能力随之提高；但过高的温度，会导致菌体衰老加快、丧失活力甚至过早死亡，产酒率大幅度降低，并可能对果酒的品质产生不利影响[25]。由图7可知，随发酵温度上升，大枣果酒的酒精度和感官评分均呈先升后降趋势，24℃时二者均达最高，即酒精度8.8%vol，感官80.4分。因发酵温度越高，能源消耗就越大，因此，综合酒精度和感官评分结果，选取适宜的发酵温度为24℃。

2.3 正交试验

正交试验结果见表4。

表4 正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment results

由表4可知，4个试验因素对大枣果酒感官品质影响顺序为B＞A＞C＞D，即发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量＞初始pH值，方差分析见表5。

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5可知，酵母接种量和初始pH值的影响不显著，发酵温度和发酵时间的影响显著。得到的最佳的工艺组合为A2B3C3D2（方案1），即接种量0.6 g/L、发酵温度为26℃、发酵时间7 d、初始pH4.0，未出现在列表中；通过验证试验将方案1与列表中感官评分最高的A2B2C3D1（方案2，即接种量0.6 g/L、发醇温度为24℃、发醇时间7 d、初始pH3.5）的试验结果进行对比分析，发现经方案2发酵的大枣果酒酒精度为8.7%vol，感官评分为89.8分，均低于方案1发酵的大枣果酒；说明F33最佳发酵工艺条件与正交结果（方案1）一致，即F33在接种量0.6 g/L、初始pH4.0时，在26℃下发酵7 d得到的大枣果酒感官评分为90.2分，酒精度9.0%vol，符合优化结果。

2.4 大枣果酒的成品质量指标检测

感官指标：大枣果酒口感好、品质佳、无异味；酒体清澈、琥珀色，枣香和酒香浓郁、舒服。

理化指标：微生物指标（菌落总数40个/mL＜50个/mL，大肠杆菌（CFU/g）未检出；酒精度为 9.0%vol；透光率为90.8%，还原糖（以葡萄糖计）为3.93 g/L）；pH值3.8；可溶性固形物为5.4%，总酸（以酒石酸计）4.8 g/L，均符合国家农业部标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》。

3 结论

以大枣果浆为原料，采用6种酿酒酵母（BO2B、X16、F33、EC-118、帝伯士、FX10）进行大枣果酒的酿制，对发酵过程中大枣果酒的酒精度和可溶性固形物变化以及发酵后的大枣果酒总酸，抗氧化性和感官评分进行比较分析，发现F33酵母发酵能力强，发酵后果酒中的各项指标均优于其它5种发酵剂发酵的大枣果酒，适合于制作大枣果酒。

在以上试验的基础上，以感官评价为指标，通过正交试验法得到了F33最佳发酵条件，对大枣果酒感官品质的影响顺序为B＞A＞C＞D，即发酵温度＞发酵时间＞酵母接种量＞初始pH值，且接种量和初始pH值的影响不显著，发酵温度和发酵时间的影响显著。经验证试验，酵母接种量0.6 g/L，初始pH4.0，26℃下发酵7 d，所得大枣果酒感官评分为90.2分，酒精度9.0%vol，且果酒品质佳，口感好，各项指标符合国家农业部标准（NY/T 1508—2017《绿色食品 果酒》），说明此条件为F33酵母菌的最佳发酵条件。